Sistema de tecnología de visualización de fagos

2.1 Sistema de presentación de fagos filamentosos monocatenarios

(1) Sistema de presentación de PIII. El bacteriófago filamentoso es un virus de ADN monocatenario. La PIII es la proteína de cubierta secundaria del virus, que se encuentra en el extremo final de la partícula del virus y es necesaria para que el fago infecte Escherichia coli. Cada partícula de virus tiene de 3 a 5 copias de la proteína PⅢ [3], que se puede dividir estructuralmente en tres regiones funcionales: N1, N2 y CT [4-5]. G1 y G2 de glicina están conectados. Entre ellos, N1 y N2 están relacionados con el fago que adsorbe los pili de Escherichia coli y penetra la membrana celular [6], mientras que CT forma parte de la estructura de la proteína de cubierta del fago y ancla el dominio C-terminal de toda la proteína PIII a un extremo de el fago [6] 7]. La PIII tiene dos sitios para insertar secuencias exógenas. Cuando se fusiona un polipéptido o proteína exógena entre el péptido señal (SgIII) y N1 de la proteína PIII, el sistema retiene la proteína PIII intacta y el fago sigue siendo infeccioso; si el polipéptido o proteína extraño está conectado directamente al dominio CT de la proteína PⅢ, el fago pierde su infectividad. En este momento, la infectividad del fago recombinante la proporciona la proteína PⅢ completa expresada por el fago auxiliar. La proteína PIII se hidroliza fácilmente mediante enzimas proteolíticas, por lo que cuando se sobreinfecta con fagos auxiliares, cada fago puede mostrar menos de una proteína de fusión en promedio, que es el llamado fago "monovalente".

(2) PVIII y otros sistemas de visualización. PⅧ es la proteína de cubierta principal del fago filamentoso. Se encuentra en el exterior del fago. El extremo C se une al ADN y el extremo N se extiende fuera del fago. Cada partícula de virus tiene alrededor de 2700 copias de PⅧ. ]. Los pentapéptidos se pueden fusionar cerca del extremo N de PVIII, pero no se pueden fusionar cadenas peptídicas más largas, porque los polipéptidos o proteínas más grandes causarán obstáculos espaciales y afectarán el ensamblaje de los fagos [2, 10-11], provocando que pierdan su infectividad. Sin embargo, cuando se trata de fagos auxiliares, se puede proporcionar proteína PVIII de tipo salvaje para reducir el precio. En este caso, se pueden fusionar polipéptidos o incluso fragmentos de anticuerpos. Además, existen informes de investigación sobre el sistema de visualización de PVI en fagos filamentosos [12]. El extremo C-terminal de la proteína PVI está expuesto en la superficie del fago y puede usarse como sitio de fusión para proteínas extrañas, y puede usarse para estudiar la función de la región estructural C-terminal de proteínas extrañas. A juzgar por la literatura disponible, este sistema se utiliza principalmente para la construcción de bibliotecas de visualización de superficie de ADNc y ha logrado buenos resultados de detección.

2.2 Sistema de visualización de fagos lambda

(1) Sistema de visualización de PV. La proteína PV del fago lambda constituye su parte tubular de la cola, que está compuesta por 32 estructuras en forma de disco, cada una de las cuales está compuesta por 6 subunidades PV. PV tiene dos regiones de plegamiento y el dominio de plegamiento C-terminal (región no funcional) puede insertarse o reemplazarse por secuencias extrañas. Las proteínas macromoleculares activas β-galactosidasa (5 ku) y lectina exógena vegetal BPA (120 ku) se han demostrado con éxito utilizando el sistema PV [13]. El fago lambda se ensambla intracelularmente, por lo que puede mostrar péptidos o proteínas que son difíciles de secretar. El número de copias de proteínas exógenas mostradas por este sistema fue un promedio de 1 molécula/fago, lo que indica que las proteínas o péptidos exógenos pueden interferir con el ensamblaje de la cola del fago lambda.

(2) Sistema de visualización de proteína D. La proteína D tiene una masa molecular de 11 ku y participa en el ensamblaje de la cabeza del fago lambda de tipo salvaje. El análisis de microscopía crioelectrónica mostró que la proteína D sobresalía de la superficie del capsómero en forma de trímeros [13]. Cuando el genoma del fago mutante es más pequeño que 82 del genoma de tipo salvaje, el ensamblaje puede completarse en ausencia de proteína D, por lo que la proteína D puede usarse como vector para la fusión de secuencias extrañas, y los polipéptidos extraños presentados se muestran espacialmente. accesible. Las partículas virales se pueden ensamblar in vivo o in vitro. El ensamblaje in vitro consiste en unir la proteína de fusión D a la superficie del fago λD, mientras que el ensamblaje in vivo consiste en transformar el plásmido que contiene el gen de fusión D en Escherichia coli lisogénica λD. especies, compensando así la proteína D carente de lisógenos y ensamblada mediante inducción de calor. Una característica interesante de este sistema es que la proporción entre la proteína de fusión y la proteína D en el fago puede controlarse mediante la actividad inhibidora del ARNt del huésped, lo que es particularmente útil para mostrar proteínas que pueden causar daño al ensamblaje del fago.

2.3 Sistema de presentación en fagos T4

El sistema de presentación en fagos T4 es un nuevo sistema de presentación establecido a mediados de los años 1990. Su característica distintiva es que puede fusionar dos péptidos o proteínas exógenos con propiedades completamente diferentes con las proteínas de cubierta SOC (9 ku) y HOC (40 ku) en la superficie de la cápside T4 respectivamente y mostrarlas directamente en la superficie de la T4. fago, por lo tanto, la proteína que expresa no requiere una purificación proteica complicada, evitando la desnaturalización de proteínas y la pérdida causada por la purificación. El fago T4 se ensambla dentro de la célula huésped y no necesita pasar por la vía secretora, por lo que puede presentar péptidos o proteínas de varios tamaños con pocas restricciones. Wu Jianmin et al. mostraron con éxito una proteína de fusión E2 de aproximadamente 215 aa SOC/m en la superficie de la cápside del fago T4 [14]. Lo que cabe destacar es que la presencia o ausencia de proteínas SOC y HOC no afecta la supervivencia y reproducción de T4. SOC y HOC pueden ensamblarse en la superficie de las cápsides en lugar del empaquetamiento del ADN durante el ensamblaje del fago. De hecho, cuando se inhibe el empaquetamiento del ADN, T4 es el único fago entre los fagos de ADN bicatenario que puede producir cápsides vacías in vivo (SOC y HOC son). también montado al mismo tiempo). Por lo tanto, cuando se utiliza T4 recombinante como vacuna, puede mostrar el antígeno objetivo en la superficie de la cápside vacía. Esta vacuna de cápside vacía que carece de ADN tiene unas perspectivas muy brillantes en términos de seguridad biológica [14].