Varios avances importantes en tecnología genética en el siglo XXI
1 Biodiversidad
La naturaleza contiene enormes recursos microbianos, pero los humanos hasta ahora no hemos podido acceder a los dos tesoros de los microorganismos de ambientes extremos (extremófilos) y los microorganismos no cultivables (microorganismos no cultivables). .profundo, por lo que el potencial de investigación y desarrollo es enorme.
Se puede esperar que las personas puedan obtener muchas enzimas, proteínas y otras sustancias activas valiosas de microorganismos extremófilos como acidófilos, alcalófilos, psicrófilos, termófilos, halófilos, barófilos, etc. En los últimos años, el desarrollo de tecnologías de producción de enzimas recombinantes ha hecho posible obtener enzimas más baratas de una gama más amplia de fuentes. El progreso realizado en esta área en los últimos años se debe en parte al avance de la tecnología de cultivo de extremófilos, pero también a la mejora de la capacidad de transferir genes de extremófilos a microorganismos huéspedes receptores comúnmente utilizados. Como resultado, la gente tiene razones para creer que se pueden producir biocatalizadores resistentes a ambientes extremos en condiciones de crecimiento suaves y baratas.
Además, se sabe que los tipos de microorganismos que se pueden cultivar en el laboratorio sólo representan menos del 1% del total de microorganismos que existen en la naturaleza. Es decir, ¡todavía existen el 99%! Hay que estudiar la existencia de microorganismos no cultivables que esperan que utilicemos métodos extraordinarios. Como exploración importante en el campo de la investigación y el desarrollo de recursos microbianos, se pueden utilizar los últimos métodos de biología molecular para evitar el paso de aislamiento y purificación de cepas y buscar directamente genes microbianos con valor de desarrollo en la naturaleza. El ADN de microorganismos no cultivados se clona en organismos huéspedes que han sido cultivados y domesticados, y luego se utiliza tecnología de detección de alto rendimiento para detectar genes que codifican nuevas enzimas a partir de clones recombinantes.
Estamos entusiasmados con las enormes oportunidades que el mundo microbiano presenta a los seres humanos. Algunas personas conocedoras señalaron que el mundo microbiano desconocido puede ser el recurso natural sin explotar más grande de la tierra. Los países con tesoros escondidos seguramente obtendrán una ventaja en el desarrollo.
2.2 Secuenciación del genoma
Con la mejora de las capacidades de secuenciación del ADN, también se ha reforzado la capacidad de analizar secuencias, por lo que se pueden descubrir muchos genes nuevos. La actividad enzimática básica del nuevo producto de expresión génica se infiere comparándolo con secuencias genéticas conocidas. Por supuesto, el estado actual de la técnica no es suficiente para deducir muchos detalles de las propiedades de estas enzimas. Por lo tanto, estos genes recién descubiertos deben expresarse para determinar si realmente son útiles en un proceso específico. Suponiendo que todas las enzimas de un organismo son funcionales a su temperatura de crecimiento normal, las secuencias de ADN de los hipertermófilos pueden ser un punto de partida razonable para encontrar enzimas que todavía sean funcionales cerca del punto de ebullición. Se puede decir lo mismo. Se cree que los genes de los psicrófilos; Los microorganismos pueden ser una posible fuente de enzimas que todavía son funcionales a temperaturas cero.
La información más reciente en Internet muestra que se han completado las secuencias del genoma de unas 60 especies de microorganismos y se espera que pronto se completen los genomas de casi 200 especies de microorganismos. Los esfuerzos de secuenciación han revelado decenas de miles de genes nuevos, principalmente genes que codifican enzimas, aproximadamente un tercio de los cuales pueden asignarse a familias "funcionales", un grupo que es abundante y cambia cada día, una fuente cada vez mayor de nuevos candidatos a enzimas industriales. Se cree que con el advenimiento de la era del genoma, los humanos descubrirán una gran cantidad de nuevas enzimas industriales.
2.3 Evolución dirigida
De todas las tecnologías cuyo objetivo principal es descubrir enzimas industriales, la evolución dirigida (ED) puede ser la más poderosa. DE es una forma rápida y económica de descubrir varias enzimas nuevas. Esta nueva clase de enzimas debería funcionar mejor que las enzimas naturales bajo ciertas condiciones. DE simula la evolución natural, que depende de la selección de "individuos" apropiados de una población diversa, donde los "individuos" son enzimas. La DE es direccional, lo que significa que los investigadores realizan mejoras paso a paso para que las diversas enzimas seleccionadas cumplan con ciertos estándares esperados. La DE comienza clonando el gen de la enzima que se va a mejorar. La diversidad de los genes aislados se mejoró mediante mutación in vitro. Luego, el ADN de estas cepas mutantes se clona y se expresa en un receptor común. La actividad enzimática del producto expresado se analiza para seleccionar el mejor clon de cepa mutante. Sus genes sirven como nuevo punto de partida para la siguiente ronda de detección.
El uso de este método requiere dominar dos tecnologías de apoyo importantes, a saber, la combinación de ADN y la tecnología de detección de alto rendimiento.
2.4 Presentación en fagos
Esta tecnología se utilizó originalmente para identificar y aislar algunos dominios estructurales de proteínas que pueden unirse firmemente a otras moléculas. Sin embargo, esta tecnología central se ha seguido diseñando y desarrollando en los últimos años, de modo que la enzima a mejorar pueda servir teóricamente como objetivo para la identificación y el aislamiento. La forma más simple de presentación en fagos implica insertar una pequeña porción de ADN objetivo (que debería ser el objetivo de la mutación y la detección) en el genoma del fago en una posición donde el dominio proteico que codifica puede aparecer en la superficie de la partícula del fago. Las mutaciones en el gen diana hacen que se muestren varios dominios en la superficie. Si alguno de los diversos dominios se une con suficiente fuerza a un sustrato inmovilizado, las partículas que codifican ese dominio se adhieren a esta fase estacionaria para separarlos de los dominios no unidos. Luego, los fagos unidos se eluyen del sustrato inmovilizado, se recogen y se propagan. Repetir este proceso aumenta las posibilidades de obtener una enzima de buena calidad.
3 Dos ejemplos
A continuación se muestran dos ejemplos basados en el trabajo de investigación de este laboratorio. Una es la enzima L-asparaginasa; la otra es el aminoácido ácido L-aspártico. Estos dos ejemplos son algo representativos en nuestra discusión sobre la tercera ola de biotecnología.
3.1 L-asparaginasa
Como fármaco antileucemia de primera elección, la L-asparaginasa se ha producido durante mucho tiempo mediante el método de fermentación de Escherichia coli, pero la producción y aplicación son al menos Hay dos problemas. Un problema es que las células tienen poca capacidad para formar la enzima; otro problema es que la enzima tiene una vida media corta en el cuerpo. La existencia de estos dos problemas ha provocado costes de producción de medicamentos excesivamente elevados y ha aumentado la carga para los pacientes.
Nuestro laboratorio ha mejorado la capacidad de síntesis de enzimas con la ayuda de tecnología de ingeniería genética. Primero, el gen que codifica la enzima se obtuvo de E. coli, se recombinó in vitro y luego se transformó en E. coli. es que los elementos reguladores aguas arriba se han fortalecido. ¡Esto aumenta enormemente la capacidad de síntesis de enzimas en más de 40 veces!
La estrategia de nuestro laboratorio para resolver el problema de la vida media corta y la mala estabilidad es preparar una fusión. proteína del anticuerpo L-asparaginasa. Primero, se seleccionó el anticuerpo protector scFv46 de la L-asparaginasa (ASNase) a partir de la biblioteca de anticuerpos de fagos y luego se construyeron las proteínas de fusión scFv-ASNase y ASNase-scFv. Los resultados de las pruebas de estabilidad muestran que estas dos proteínas de fusión son más resistentes a la degradación de proteasas que la ASNasa natural y aumentan la vida media in vitro de la ASNasa natural de 2 horas a 9 horas y 6 horas respectivamente. a altas temperaturas y condiciones de bajo pH son altamente resistentes. Mediante tecnología de simulación por computadora, se predijeron las estructuras tridimensionales de las proteínas de fusión ASNase-scFv y scFv-ASNase y se compararon con las estructuras tridimensionales informadas de la ASNase natural. Mediante análisis estructural y combinado con los resultados experimentales anteriores, se propone que el mecanismo de protección de scFv es el resultado combinado del efecto de impedimento estérico de scFv (como el bloqueo del sitio de acción de la proteasa) y el cambio de la superficie del potencial electrostático de la molécula de enzima. .
Un nuevo intento de mejorar aún más la estabilidad de la L-asparaginasa con la ayuda de información completa de la secuencia del genoma. Gracias a los incansables esfuerzos de un equipo de científicos de la Academia de Ciencias de China en los últimos años, han completado la investigación de secuenciación del genoma completo de 2.689.443 pb de un microorganismo termófilo extremo. Para mejorar aún más la estabilidad de la L-asparaginasa y alargar la vida media del fármaco in vivo, hemos hecho un nuevo esfuerzo en este sentido, es decir, intentar encontrar una enzima más estable a partir de un microorganismo termófilo extremo con la ayuda de información completa de la secuencia del genoma. Buena L-asparaginasa.
Este laboratorio ha medido E. coli L: secuencia de aminoácidos de la asparaginasa y secuencia de nucleótidos del gen que la codifica. Busque en la base de datos completa de secuencias del genoma de los microorganismos termófilos extremos mencionados anteriormente para E. coli L: análogo estructural de la asparaginasa, da como resultado el No. Entre las proteínas codificadas por el gen nº 967 se encontró una proteína cuya estructura primaria es muy similar a la L-asparaginasa.
Entre ellos, el 35% (115/323) de los aminoácidos son exactamente iguales, y otro 52% (171/323) de los aminoácidos son similares. Por lo tanto, hay razones para creer que en este microorganismo termófilo extremo es probable que exista una especie relacionada con E. coli L: proteína con funciones similares a la asparaginasa. Y dado que el gen proviene de un microorganismo extremadamente termófilo, se espera que esta proteína también tenga una mejor estabilidad térmica. Por supuesto, todas las conclusiones estarán sujetas a confirmación o aclaración final a través de los resultados de la clonación, expresión, aislamiento del producto y análisis funcional del gen.
3.2 Ácido L-aspártico
El método de producción habitual consiste en utilizar células microbianas ricas en L-aspartasa, y tras su inmovilización, hacer reaccionar el sustrato con ácido butenodioico se convierte en ácido L-aspártico. . Este laboratorio también realizó algunos trabajos iniciales y los puso en aplicaciones de producción. En la Conferencia de Biotecnología de Berlín en 2000, me enteré de que una empresa japonesa había adoptado una serie de medidas de mejora para mejorar en gran medida el nivel del proceso de producción. En primer lugar, para resolver el problema de la baja capacidad de síntesis de enzimas, también se utiliza tecnología de ingeniería genética para aumentar la capacidad de síntesis 50 veces; el problema de permeabilidad de las enzimas inmovilizadas se resuelve mediante el uso de materiales con propiedades de reacción de intercambio iónico; diseño del reactor y reducción de la temperatura de reacción, reducida de 37°C a 20°C; se ha eliminado el subproducto ambientalmente contaminante sulfato de amonio y se ha reemplazado con fumarato de amonio reutilizable; se están desarrollando nuevos usos del ácido L-aspártico para la fabricación de poli; -L —Aspartasa. Este nuevo proceso mejorado es avanzado y eficiente, además de ecológico y respetuoso con el medio ambiente. El proceso de producción de este producto casi ha alcanzado la perfección, representando la dirección de la transformación de las industrias tradicionales en el siglo XXI.
4 Estructura industrial
Estamos en una era en la que algunos de los principales obstáculos encontrados en el desarrollo social y económico deben resolverse mediante la biotecnología industrial. El rápido desarrollo de la ciencia y la tecnología ha formado una forma; Un lote de plataformas tecnológicas avanzadas; muchos ejemplos muestran que la tercera ola de biotecnología está llegando. Creemos que en esta tercera ola, la estructura de la biotecnología industrial de China y del mundo experimentará cambios tremendos.
El patrón de la industria biotecnológica industrial del siglo pasado incluye generalmente antibióticos, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos (ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido itacónico, ácido málico, ácido glucónico, etc.), preparaciones enzimáticas, monómeros Proteínas celulares, disolventes (acetona, butanol), etanol, ácidos nucleicos, nucleótidos, etc. Transformación tecnológica integral de las industrias tradicionales: transición a industrias de alto rendimiento, alta calidad, eficientes, que ahorran recursos y respetuosas con el medio ambiente, y definitivamente nacerán una serie de nuevas industrias, incluida la industria de biomateriales, la industria de la bioenergía, la industria bioquímica, la industria ambiental. industria biotecnológica, etc.