Cuénteme sobre los métodos y procedimientos experimentales para la identificación de cepas bacterianas.
Individuos morfológicos: morfología celular, reacciones de tinción, diversas estructuras especiales, etc.
*Requerimientos nutricionales: energía, fuente de carbono, fuente de nitrógeno, factores de crecimiento, etc.
*Enzimas de reacción fisiológica y bioquímica; tipos de enzimas producidas y propiedades de reacción, etc.
*Metabolitos: tipo, rendimiento, reacción de color, etc.
Indicadores clásicos de características ecológicas: temperatura de crecimiento, demanda de oxígeno, especies hospedadoras, etc.
*Características de la historia de vida
*Respuesta serológica
*Sensibilidad a los fagos
*Otros
Clasificación clásica
La clasificación clásica es un método tradicional de clasificación de microorganismos con una historia de más de 100 años. Se caracteriza por seleccionar artificialmente varias características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas para su clasificación y dividir las características fenotípicas en niveles primarios y secundarios. Generalmente, las unidades taxonómicas por encima del nivel familiar se distinguen por sus características morfológicas, mientras que las unidades taxonómicas por debajo del nivel familiar se distinguen por su morfología combinada con características fisiológicas y bioquímicas. * a. Puede crecer por encima de los 60 grados Celsius
* B. Las células son más grandes, con un ancho de 1,3 ~ 1,8 mm............. .... ................................................. ........................................................... .......................... ............
* B. Las células son más pequeños, con un ancho de 0,4 ~ 0,8 mm.
*C. Puede crecer utilizando glucosa como fuente de carbono.
*D. Puede crecer a pH 4,5............................. ..... ................................................. .......... ........................................ ......................... ........................
*DD. No puede crecer a pH 4,5................................................ ..... ................................................. .......... ........................................ ......................... .............
*CC. La glucosa no se puede utilizar como única fuente de carbono................................. ............ ................................................. ... ................................................. .................. .................
*AA. No puede crecer por encima de los 60 grados centígrados.
2. Métodos modernos de clasificación e identificación
En los últimos años, con el desarrollo de la biología molecular y la aplicación generalizada de nuevas tecnologías, la clasificación e identificación de microorganismos se ha desarrollado rápidamente. La identificación de microorganismos ha pasado por el proceso desde la caracterización fenotípica clásica hasta la caracterización genética moderna, el análisis preciso de los componentes químicos de las células y la investigación de clasificación numérica mediante computadoras electrónicas.
* (A) Identificación de genotipos microbianos
* El ADN es el portador de información genética de todos los microorganismos excepto de unos pocos virus de ARN. Cada microorganismo tiene su propia composición y estructura de ADN únicas y estables. Las diferencias en la composición y estructura del ADN entre diferentes microorganismos representan la distancia de su nueva relación. Por lo tanto, determinar algunos datos importantes del ADN de cada microorganismo es un indicador extremadamente importante en la identificación microbiana:
1. La composición de bases del ADN (G+Cmol%) * GC mol% en el ADN de cada microorganismo. El valor es constante y no cambiará con los cambios en las condiciones ambientales y de cultivo. Además, el valor del% molar de GC en el ADN no difiere mucho entre diferentes especies del mismo género, y puede agruparse alrededor de un cierto valor para mostrar el rango de% molar de GC en la misma especie microbiana. El análisis de% molar de GC en el ADN se utiliza principalmente para distinguir géneros y especies bacterianas, porque el contenido de GC en el ADN bacteriano generalmente está entre 25% y 75%, la proporción de GC en el ADN de actinomicetos es muy estrecha (37% a 51%).
Generalmente se cree que si el contenido de GC de dos microorganismos cualesquiera difiere en más del 10%, los dos microorganismos definitivamente no son la misma especie. Por lo tanto, g+c% mol se puede utilizar para identificar la relación genética y la distancia entre varias especies microbianas. Vale la pena señalar que las bacterias estrechamente relacionadas tienen el mismo o similar contenido de % molar de G+c, pero las bacterias con el mismo o similar% molar de G+c no son necesariamente similares en relación genética, porque estos datos no pueden reflejar la relación entre pares de bases. La secuencia de disposición, por ejemplo, el% molar GC de ADN de actinomicetos está entre 37 y 51, lo que obviamente no puede distinguir docenas de géneros de actinomicetos en un rango tan pequeño. Para comparar si las secuencias de pares de bases del ADN de dos bacterias son iguales y en qué medida son iguales, es necesaria una prueba de hibridación de ácidos nucleicos.
1. La composición de bases del ADN (G+Cmol%)* 1) Cada especie biológica tiene un rango de GC% específico, por lo que este último puede usarse como indicador para clasificación e identificación. El rango de GC% de bacterias es del 25-75%, con la mayor variación, por lo que es más adecuado para la clasificación e identificación de bacterias.
* 2) La medición del % de GC se utiliza principalmente para identificar bacterias cuyas características fenotípicas son difíciles de distinguir. Puede probar la racionalidad de la clasificación de las características fenotípicas a nivel molecular y determinar la relación genética de las especies.
* 3) Principios de uso:
* La comparación del contenido de G+C se utiliza principalmente para negar que cada organismo tenga una determinada composición base, y los organismos con relaciones genéticas cercanas deberían tiene contenido G+C similar. Si el contenido de G+C de diferentes organismos varía mucho, significa que están muy separados. Sin embargo, el hecho de que organismos con contenido similar de G+C no signifique necesariamente que estén estrechamente relacionados.
1. La composición de bases del ADN (G+Cmol%)* La diferencia en el contenido de G+C entre diferentes cepas de la misma especie debe ser inferior al 4 ~ 5% de la diferencia entre diferentes especies de; el mismo género debe ser inferior al 10 ~ 15 %. Por lo tanto, el contenido de G+C ha sido considerado como una característica básica para establecer una nueva unidad taxonómica microbiana, la cual es de gran importancia para la clasificación e identificación de especies, géneros e incluso familias.
*Si dos cepas son similares en morfología, características fisiológicas y bioquímicas, si la diferencia en el contenido de G+C es superior al 5%, definitivamente no son la misma especie, y si es superior al 15% %, definitivamente no son el mismo género.
*El contenido de G+C es un índice de identificación importante e indispensable a la hora de identificar cepas difíciles, nombrar nuevas especies y establecer nuevos taxones. Su importancia taxonómica es principalmente una característica básica para establecer un nuevo taxón y para excluir de un taxón especies con grandes diferencias en el contenido de G+C.
2. Composición de bases de ácidos nucleicos e hibridación molecular: *A diferencia de la comparación de características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, la comparación de la composición de bases del ADN y la hibridación molecular de ácidos nucleicos comparan directamente las diferencias en los genomas entre diferentes microorganismos. Por tanto, los resultados son más fiables.
Hibridación ADN-ADN
* El principio básico de la hibridación del ADN es utilizar la reversibilidad de la fusión del ADN y la especificidad del emparejamiento de bases para fundir ADN de diferentes fuentes in vitro de forma apropiada. En estas condiciones, las bases complementarias se reparan y combinan en ADN de doble hebra, y luego se detecta el porcentaje de heterocigosidad en función de la situación que puede producir ADN de doble hebra. Si las secuencias de bases de dos ADN monocatenarios son iguales, se puede formar un ADN bicatenario completo, es decir, la tasa de hibridación es del 100%. Si las secuencias de bases de dos ADN monocatenarios son sólo parcialmente idénticas, entonces el "bicatenario" que pueden generar sólo contiene un ADN monocatenario parcial y su tasa de hibridación es inferior al 100%. Por tanto, cuanto mayor sea la tasa de heterocigosidad, mayor será la similitud de las secuencias de bases entre los dos ADN y más estrecha será la relación genética entre ellos. Por ejemplo, la tasa de hibridación del ADN de dos cepas de E. coli puede llegar al 100 %, mientras que la tasa de hibridación del ADN de E. coli y Salmonella es inferior, alrededor del 70 %. La determinación de g+cmol% y los experimentos de hibridación de ADN han abierto nuevas formas para la clasificación de especies bacterianas y han resuelto algunos problemas que no se pueden resolver basándose en características aparentes. Sin embargo, la relación entre muchas unidades taxonómicas por encima del género y la evolución bacteriana aún no se puede resolver. resuelto.
Hibridación ADN-ARN
*Actualmente existen dos métodos para estudiar las secuencias de bases del ARN. Uno es la hibridación de ADN y ARNr, y el otro es el análisis de secuencia de oligonucleótidos de ARNr 16S. Los principios básicos y los métodos experimentales de la hibridación ADN-ARNr son los mismos que los de la hibridación de ADN. La diferencia es: ① La parte marcada con isótopos de la hibridación del ADN es ADN, mientras que la parte marcada con isótopos de la hibridación ADN-ARNr es ARNr. ②Los resultados de la hibridación de ADN se expresan como porcentaje de homología, mientras que los resultados de la hibridación de ADN y ARNr se expresan como Tm(e) y número de unión de ARN. El valor de Tm(e) es la temperatura necesaria para fundir la mitad del híbrido ADN-ARNr. El número de unión de ARN es la cantidad de mg de ARNr unidos a 100 mg de ADN. En base a este parámetro, se puede realizar un mapa de similitud de ARN. En el mapa de similitud de ARNr, las bacterias estrechamente relacionadas se agrupan. Las bacterias distantes ocupan diferentes lugares en el mapa. La comparación de los datos experimentales de rRNA cistrans con experimentos de homología de rRNA y la similitud de los catálogos de oligonucleótidos de rRNA 16S puede conducir a un concepto filogenético más consistente de los taxones bacterianos por encima del género y conducir al establecimiento de Archaea.
3. Se construyó un árbol filogenético de 16 S rRNA.
* a) Hacer que el alcance de la investigación de la evolución biológica cubra verdaderamente todos los grupos biológicos;
La investigación tradicional sobre la evolución biológica se basa principalmente en morfología compleja y registros fósiles, por lo que es en su mayoría limitada; a los animales de investigación epigenética, y los metazoos sólo representan 1/5 de todo el proceso de evolución biológica.
* b) Proponer un método completamente nuevo para medir correctamente la relación filogenética entre organismos
* c) Proporcionar pistas y teorías para explorar el origen de la vida y el proceso de desarrollo de; Base de vida primitiva;
d) rompe la limitación de la clasificación bacteriana basándose únicamente en características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, y establece una nueva teoría de clasificación e identificación microbiana;
* e ) proporciona biodiversidad microbiana y el estudio de la ecología microbiana, especialmente el estudio directo de microorganismos en el entorno ecológico sin cultivo, estableció nuevas teorías y métodos de investigación.
Análisis de secuencia de oligonucleótidos de ARNr 3.16S.
*En primer lugar, el 16S rRNA es ubicuo en procariotas (su molécula homóloga en eucariotas es el 18S rRNA). El ARNr participa en el proceso de síntesis de proteínas biológicas. Su función es esencial para cualquier organismo. Permanece inalterable durante el largo proceso de evolución biológica y puede considerarse como el reloj de la evolución biológica. En segundo lugar, la molécula 16S rRNA contiene regiones de secuencia altamente conservadas y regiones de secuencia moderadamente conservadas y altamente variables, por lo que es adecuada para estudiar las relaciones genéticas de varios organismos con diferentes distancias evolutivas. En tercer lugar, el peso molecular relativo del ARNr 16S es moderado, alrededor de 1540 nucleótidos, lo que facilita el análisis de secuencia. Por tanto, puede utilizarse como una excelente herramienta para medir la evolución y las relaciones genéticas de diversos organismos.
Aislamiento del gen rna de la cepa 16s.
* . Elija un círculo de células de cepa aisladas directamente de la placa, agregue 100 μL de agua redestilada estéril, agite para mezclar, hierva durante 2 minutos y centrifugue a 12000 rpm-1 durante 5 minutos. El sobrenadante contiene el gen 16S rRNA y. Se puede utilizar directamente para aumentar la amplificación por PCR. Los pasos generales para la amplificación por PCR y la secuenciación del gen de ARNr del aislado de ARNr 16S son los siguientes: cebadores de PCR para el gen de ARNr 16S: cctgg CTC Ag-3' en 5'-agagt TTG 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-; 3'. El volumen de la reacción de amplificación es de 50 ml y las condiciones de reacción son predesnaturalización a 95 °C durante 5 minutos, desnaturalización a 94 °C durante 65438 ±0 minutos, recocido a 55 °C durante 65438 ±0 minutos, extensión a 72 °C. durante 2 minutos, * * * 29 ciclos. Las reacciones de PCR se realizaron en un ciclador térmico PTC-200. Tome 5 ml de la solución de reacción y realice la detección por electroforesis en un gel de agarosa de 10 g L -1. La secuenciación de productos de PCR puede ser completada por empresas de tecnología especializadas.
Análisis comparativo
*La secuencia parcial del ADNr 16S de la cepa aislada se obtuvo mediante secuenciación. Esta secuencia generalmente se guarda en formato *.f.seq y se puede abrir con el software WordPad o Editsequence. Compare y analice la secuencia obtenida con los datos de ácido nucleico en GenBank utilizando el programa blast (http://www. NCBI. NLM. NIH. gov/Blast). Los pasos específicos son los siguientes: Haga clic en nucleótido-nucleótido en el sitio web. Opción BLAST [blastn], pegue la secuencia obtenida al secuenciar en el espacio en blanco de la página web "Buscar", o ingrese al directorio de la carpeta donde se encuentran los resultados de la secuenciación, haga clic en la opción de comparación de ácidos nucleicos, es decir, "Blast", luego haga clic en "Formatear" y la computadora comenzará automáticamente a buscar secuencias alineadas en la base de datos de nucleótidos y enumerará secuencias similares e información relacionada sobre especies o géneros y cepas según la homología, para juzgar preliminarmente los resultados de identificación de 16S. ADNr.
Análisis comparativo
* Se construyen matriz de distancia genética y árbol filogenético. La distancia genética entre muestras se puede calcular a través del programa MegAlign en el paquete de software DNAStar. Obtenga las secuencias de cepas relevantes de GenBank, ingrese al programa Clustalx1.8 para organizar secuencias homólogas de ADN y verifique cuidadosamente manualmente. Sobre esta base, la secuencia se ingresó en el paquete de software Phylip3.6 y se construyó un árbol filogenético utilizando el método de reducción. La confianza en cada rama del árbol filogenético se probó 500 veces mediante bootstrap utilizando el método de dos parámetros de Kimura, dando igual peso a las transiciones y transversiones en la variación de la secuencia de ADN.
(2) Identificación de componentes químicos de las células* La determinación de otros componentes químicos, excepto los componentes de ácidos nucleicos mencionados anteriormente, es una parte importante de la clasificación química de los microorganismos e incluye principalmente: 1. La composición química de la pared celular. 2. Glicoformas de hidrolizados de células enteras. 3. Análisis de fosfolípidos. 4. Análisis de ácido micólico. 5. Análisis de quinonas. 6. Aplicación de la tecnología de cromatografía de gases.
(2) Identificación de los componentes químicos de las células
*En la clasificación microbiana, el método de clasificar los microorganismos en función de los componentes químicos característicos de las células microbianas se denomina taxonomía química. En las últimas dos décadas se han utilizado técnicas químicas y físicas para estudiar la composición química de las células bacterianas y se han obtenido valiosos datos de clasificación e identificación. En la tabla se muestra la importancia de varios componentes químicos en la clasificación de los microorganismos procarióticos.
Análisis de la composición química de las bacterias y su aplicación en taxonomía
La importancia de la identificación de los componentes químicos de las células
*Con el desarrollo de la biología molecular, las células El análisis de la composición química es cada vez más importante para la clasificación microbiana. El tipo y la cantidad de aminoácidos en la pared celular se han considerado criterios de clasificación importantes a nivel bacteriano. En la clasificación de actinomicetos, el análisis de los componentes de la pared celular y los azúcares característicos de las células se ha utilizado ampliamente como base para la clasificación. Los lípidos son uno de los criterios que distinguen a las bacterias de las arqueas. Las bacterias tienen ésteres de acilo (enlaces grasos) y las arqueas tienen ésteres de éter, por lo que la presencia de ésteres de éter se puede utilizar para distinguir las arqueas. El análisis y determinación de ácido micólico se ha convertido en uno de los métodos de rutina para la clasificación e identificación de Nocardia actinomycetes. La esfingosina está contenida en la membrana celular de Sphingomonas spp. y Sphingomonas spp. , por lo que la presencia o ausencia de esfingosina es un indicador importante de este tipo de bacterias. Además, el análisis de quinonas isoprenoides, citocromos y espectros infrarrojos en la membrana plasmática de algunas bacterias también es valioso para la identificación de algunas familias, géneros y especies de bacterias y actinomicetos.
(3) Clasificación numérica
*La clasificación cuantitativa, también conocida como clasificación estadística, fue desarrollada por M. Adan hijo (1727 ~ 1806, planta francesa), contemporáneo de Linneo. Hace unos 200 años se desarrolló basándose en los principios de clasificación desarrollados por los científicos) y con la ayuda de la tecnología informática moderna. Los pasos básicos de la clasificación numérica son: (1) Calcular el coeficiente de similitud entre dos cepas; (2) Enumerar la matriz de similitud (3) Convertir el diagrama matricial en un espectro de árbol;
Pasos básicos de la clasificación numérica
Clasificación numérica
* También conocida como clasificación de Adelson. Su característica es que se clasifica según muchas características, generalmente de 50 a 60, y hasta 100. En la clasificación, cada característica es igualmente importante. Suele determinarse en función de la morfología, características fisiológicas y bioquímicas, respuesta y tolerancia al medio ambiente y características ecológicas. Finalmente, las cepas probadas se comparan entre sí, el valor de similitud total entre las cepas se calcula por computadora y se enumera la matriz de valores de similitud (Figura 14-5). Para facilitar la observación, la matriz debe reorganizarse de modo que las cepas con alta similitud se enumeren juntas, y luego el diagrama de la matriz debe convertirse en un dendrograma y combinarse con un juicio subjetivo (como dividir aquellas con una similitud superior al 85 % en la misma especie, la similitud Más del 65% se clasifican en el mismo género, etc.), y todos los grupos taxonómicos están ordenados.
Ventajas de la clasificación numérica
Las ventajas de la clasificación numérica son que la clasificación de grupos es objetiva y estable basándose en el análisis de un gran número de características de clasificación y promueve una investigación exhaustiva; y análisis de taxones bacterianos. Las observaciones han acumulado una gran cantidad de datos para la clasificación e identificación de bacterias. Sin embargo, cuando se utilizan métodos de clasificación numérica para clasificar cepas bacterianas en grupos, especies y géneros, las bases de ADN G+Cmol % de las cepas en cuestión deben hibridarse con el ADN para una mayor confirmación.