Tecnología de secuenciación de secuenciación de ADN
Según el historial de desarrollo, la influencia, los principios y las tecnologías de secuenciación, existen principalmente los siguientes tipos: secuenciación masiva de firmas paralelas, MPSS, secuenciación Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación sólida ABI, La secuenciación de semiconductores de iones, la secuenciación de nanoesferas de ADN y otros analizadores genéticos (secuenciadores de ADN) utilizan tecnología de electroforesis capilar en lugar de la electroforesis tradicional en placas de poliacrilamida, y utilizan el ddNTP (método de terminador etiquetado) marcado con tinte fluorescente de cuatro colores patentado por la compañía. Por lo tanto, mediante una reacción de secuenciación por PCR con un solo cebador, el producto de PCR generado es una mezcla de ADN monocatenario con cuatro tintes fluorescentes diferentes en el extremo 3', que difieren en 1 base, de modo que los productos de secuenciación de PCR de los cuatro tintes fluorescentes pueden Estar en un tubo capilar Electroforesis, evitando carriles de nado. La movilidad en la electroforesis capilar también es diferente debido a los diferentes tamaños de las moléculas. Un detector de cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) en la ventana del detector láser puede detectar moléculas fluorescentes una por una a medida que pasan a través de la ventana de lectura capilar. La fluorescencia excitada se segmenta mediante una rejilla para distinguir diferentes colores de fluorescencia que representan información diferente del sustrato, y las imágenes se sincronizan en una cámara CCD. El software de análisis puede convertir automáticamente diferentes fluorescencias en secuencias de ADN para lograr el propósito de la secuenciación del ADN. Los resultados del análisis se pueden generar en diversas formas, como patrones de electroforesis en gel, patrones de picos de absorción de fluorescencia o secuencias de disposición de bases.
Es un instrumento de precisión avanzado que utiliza control automático por ordenador, como llenado automático de gel, muestreo automático, recogida y análisis automático de datos, para medir la secuencia de bases, el tamaño y la cuantificación de fragmentos de ADN. PE también ofrece polímeros en gel, incluidos geles de secuenciación de ADN (POP 6) y geles GeneScan (POP 4). Los tamaños de poro de estas partículas de gel son uniformes, lo que evita el impacto de condiciones de preparación de gel inconsistentes en la precisión de la secuenciación. Consiste principalmente en un dispositivo de electroforesis capilar, una computadora Macintosh, una impresora a color y accesorios de electroforesis. Las computadoras incluyen software para la recopilación de datos, el análisis y la operación de instrumentos. Utiliza el último detector de cámara CCD para acortar la secuenciación de ADN a 2,5 horas y el análisis del tamaño de los fragmentos de PCR y el análisis cuantitativo de 10 a 40 minutos.
Debido a que el instrumento tiene las funciones de secuenciación de ADN, análisis del tamaño de fragmentos de PCR y análisis cuantitativo, puede realizar secuenciación de ADN, análisis heterocigótico, análisis de polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP), análisis de secuencia de microsatélites y fragmento largo. PCR, RT-PCR (PCR cuantitativa) y otros análisis. Además de la secuenciación de ADN convencional, también puede realizar análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), detección de mutaciones genéticas, comparación de HLA y medicina forense.
1. Preparación
Reactivo principal para 1. El kit de reacción de secuenciación BigDye es BigDye Mix, que contiene ddNTP marcados con fluorescencia de cuatro colores y dNTP ordinarios patentados por PE, ADN polimerasa FS AmpliTaq, tampón de reacción, etc.
2.pGEM-3Zf (+) plantilla de control de ADN bicatenario 0,2 g/L, kit de reactivos de soporte.
3.M13(-21) cebador TGTAAAACGACGGCCAGT, 3,2 μmol/L, es decir, 3,2 pmol/μl, es el reactivo del kit.
4.La plantilla de secuenciación de ADN puede ser producto de PCR, ADN monocatenario y ADN plasmídico. Es necesario ajustar la concentración de la plantilla y 1 µl es apropiado para la reacción de PCR. La concentración de ADN plasmídico determinada en este experimento fue de 0,2 g/l, que es 200 ng/μl.
5. Los cebadores deben diseñarse de acuerdo con el fragmento de ADN que se va a analizar. Los cebadores directos o inversos deben prepararse a 3,2 μmol/L, es decir, 3,2 pmol/μ L. Si el plásmido recombinante contiene. Como secuencia de cebador universal, también se puede utilizar un cebador universal, tal como el cebador M13(-21) y el cebador T7.
6. Desinfectar con agua desionizada o agua triple destilada.
7,0,2 ml o separar con tapón de tubo PCR de 0,5 ml.
8,3 mol/L de acetato de sodio (pH 5,2) Pesar 40,8 g de NaAc·3H2O, disolverlo en 70 ml de agua destilada, ajustar el pH a 5,2 con ácido acético glacial, diluir a 100 ml y esterilizar en autoclave. Embalaje posterior.
Etanol 9,70% y etanol absoluto.
10.La mezcla de NAAC/etanol se puede almacenar a temperatura ambiente10. NaAc/L mezclando 37,5 ml de etanol absoluto y 2,5 ml de NaAc 3 mol/L.
11.Gel secuenciador POP 6.
12. Reactivo de supresión de plantilla (TSR).
Tampón de electroforesis 13,10×.
14. Secuenciador automático de ADN.
15. Instrumento PCR
16. Centrífuga refrigerada de alta velocidad de sobremesa.
17. Centrífuga de sobremesa de alta velocidad o centrífuga de bolsillo.
2. Reacción de secuenciación por PCR
1. Tome un tubo de PCR de 0,2 ml, etiquételo con un marcador, inserte el tubo en hielo granulado y agregue los reactivos de acuerdo con la siguiente tabla:
Tubo de control estándar para medir tubos plantilla con reactivos añadidos
Mezcla BigDye 1 μl 1 μl
ADN plásmido 1 μl-
PGEM -3Zf (+) ADN bicatenario-1 μ l
Cebador directo 1 μ l-
Cebador M13(-21)-1 μ l
2 µl de agua desionizada estéril 2 µl
El volumen total de reacción es de 5 µl. No agregue aceite mineral ligero ni aceite de parafina, mezcle con un tubo de dedo flexible y centrifugue ligeramente.
2. Coloque el tubo de PCR en la máquina de PCR 9600 o 2400 para su amplificación. Después de la desnaturalización a 98°C durante 2 min, los parámetros del ciclo de PCR fueron 96°C durante 10 s, 50°C durante 5 s y 60°C durante 4 min, 25 ciclos, y la temperatura posterior a la amplificación se fijó en 4 °C.
3. Purificación de productos de PCR mediante el método de acetato de sodio/etanol
1. Centrifugar la mezcla y transferir el producto de amplificación a un tubo EP de 1,5 ml.
2. Añadir 25 μl de solución mixta de acetato de sodio/etanol, agitar bien y colocar en hielo durante 10 minutos para precipitar el ADN. Centrifugar a 12.000 rpm durante 30 min a 4°C y desechar con cuidado el sobrenadante.
3. Añadir 50μl de etanol al 70% (V/V) y lavar el precipitado dos veces. Centrifugar a 12000 r/min durante 5 min a 4°C, desechar con cuidado el sobrenadante y las perlas de la pared del tubo y secar al vacío el precipitado durante 10 a 15 min.
Cuarto, procesamiento de productos de PCR de secuenciación antes de la electroforesis.
1. Agregue 12 μl de TSR al tubo de centrífuga, agite vigorosamente para disolver completamente el precipitado de ADN y centrifugue ligeramente.
2. Transferir la solución a un tubo PCR de 0,2 ml separado del tapón y centrifugar ligeramente.
3. Realizar la desnaturalización térmica en una máquina de PCR (95 °C durante 2 minutos) y luego enfriar en hielo hasta su uso.
Verb (abreviatura de verbo) funciona en 1 computadora. Instale el capilar de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del instrumento, corrija la posición del capilar, llene manualmente el pegamento y establezca el archivo de secuencia de ejecución. 2. El instrumento inyectará automáticamente pegamento en el capilar, realizará una preelectroforesis a 1,2 kV durante 5 minutos, inyectará muestras automáticamente según la secuencia programada, realizará una preelectroforesis a 1,2 kV durante 20 minutos y realizará una electroforesis a 7,5 kV durante 2 horas 3. Una vez completada la electroforesis, el instrumento se limpiará automáticamente, llenará el gel, ingresará la siguiente muestra, preelectroforesis y electroforesis. 4. El tiempo total de electroforesis para cada muestra es de 2,5 horas. 5. Una vez completada la electroforesis, el instrumento analizará o imprimirá automáticamente una tabla de secuenciación de colores.
6. El analizador de secuencia realizará automáticamente el análisis y la comparación de secuencia según los requisitos del usuario. Si se conoce la secuencia de secuenciación, puede marcar diferentes bases con asteriscos mediante la alineación de secuencias para mejorar la eficiencia del trabajo.
7. Limpieza y secuenciación del instrumento Realice la limpieza y el mantenimiento del instrumento de acuerdo con los procedimientos operativos del instrumento.
Ocho. Cálculo
1. Fórmula de cálculo de la precisión de la reacción de secuenciación: 100 % del número de bases de diferencia (excluido el número N)/650 × 100 %.
2. Las bases diferenciales se refieren a bases donde la secuencia de ADN determinada es diferente de la secuencia de ADN estándar conocida, y N es una base que el instrumento no puede leer. El sistema de secuenciación de ADN SILVER SEQUENCETM es un sistema de análisis de secuencia no radiactivo que detecta bandas en geles mediante un método sensible de tinción con plata. La tinción con plata proporciona una alternativa más rápida y económica a la radiactividad o la fluorescencia. Los resultados de la secuenciación están disponibles el mismo día; la secuencia se puede leer 90 minutos después de completarse la electroforesis, lo que no es posible con la secuenciación radiactiva convencional. Además, el sistema SILVER SEQUENCETM utiliza oligonucleótidos 5'OH no modificados como cebadores, lo que reduce el costo de los oligonucleótidos específicamente modificados. El sistema no requiere una manipulación cuidadosa de los isótopos en métodos radiactivos, ni requiere reactivos costosos para técnicas de fluorescencia o quimioluminiscencia. Además, no hay necesidad de instrumentación para detectar bandas de secuencia, como es el caso con la mayoría de los métodos de fluorescencia.
La ADN polimerasa Taq tiene una fuerte estabilidad térmica a 95°C. La ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación utilizada en este sistema es un producto mejorado de la ADN polimerasa Taq. Funciona muy bien en plantillas de ADN bicatenario, con alta precisión, bandas uniformes y fondo bajo.
El sistema SILVER SEQUENCETM contiene una mezcla de nucleótidos modificada, como 7-deazadgtp (7-deazadgtp o dITP) en lugar de dgtp, que elimina la compresión de bandas causada por regiones ricas en GC.
La temperatura de recocido es el factor más importante en la secuenciación del ciclo térmico. Las altas temperaturas de recocido pueden reducir la estructura secundaria de la plantilla. Mejore la rigurosidad de los emparejamientos de imprimación y plantilla. El recocido de hebras y la estructura secundaria de la plantilla limitan los productos de PCR de fragmentos pequeños (:24mer). Los cebadores con un contenido de GC de aproximadamente el 50 % pueden obtener los mejores resultados.
En comparación con los métodos de secuenciación convencionales, este sistema tiene las siguientes ventajas: (1).
La amplificación lineal del ADN molde en este método produce suficiente producto para permitir que la tecnología de tinción con plata detecte bandas de secuencia. La reacción de secuenciación requiere de 0,03 a 2 pmol de ADN molde, según el tipo de molde. (2) La alta temperatura en cada ciclo de desnaturalización puede reemplazar la desnaturalización con álcali y la precipitación con etanol de las plantillas de ADN bicatenario (ADNds). El ciclo de desnaturalización también puede ayudar a eliminar los problemas causados por la rápida reasociación de plantillas de ADNds lineales (como la PCR). productos de reacción). (3) La reacción de la polimerasa a alta temperatura debilita la estructura secundaria de la plantilla de ADN, permitiendo que la polimerasa pase a través de regiones de estructura secundaria alta.
Primero, preparación de reactivos
1. Kit de secuenciación de ADN Silver Sequencing.
2. Solución madre de acrilamida y metilen bisacrilamida (38 % acrilamida p/v, 2 % metilen bisacrilamida p/v): 95 g de acrilamida, 5 g de metileno. Disolver la bisacrilamida en 140 ml de agua bidestilada. ajustar el volumen a 250 ml, filtrar con un filtro de 0,45 mm, conservar en un frasco marrón y conservar en nevera a 4°C durante 2 semanas.
Persulfato de amonio al 3,10%, disolver 0,5 g de persulfato de amonio en 4 ml de agua y diluir a 5 ml. Se debe utilizar recién.
4,10×tampón TBE (1 mol/L Tris, 0,83 mol/L ácido bórico, 10 mmol/L EDTA): 121,1 g Tris, 51,35 g ácido bórico.
5.Tampón de electrodo TBE: diluya 10×TBE tampón a 1×TBE para su uso posterior.
6. Termo
7. Solución fijadora/parada: 2 litros de ácido acético glacial al 10% (V/V) para su uso posterior.
8. Solución colorante: 2 g de nitrato de plata y 3 ml de formaldehído, disueltos en 2 litros de agua ultrapura y reservado.
9. Revelador: Disolver 60 g de carbonato de sodio (Na2CO3) en 2 litros de agua ultrapura, añadir 3 ml de formaldehído 37% y 40 ml de solución de tiosulfato de sodio (10 mg/ml) antes de su uso. .
Etanol al 10,95%.
11,0,5% de ácido acético glacial.
12. SigmaKit (Sigma Cat. #SL-2).
Segunda reacción de secuenciación
1 Para cada reacción de secuenciación, etiquete cuatro eppendorf de 0,5 ml. tubos de ensayo (G, A, T, C). Agregue 2 ml de la mezcla d/ddNTP adecuada (mezcla d/ddNTP) a cada tubo. Agregue 1 gota (aproximadamente 20 μl) de aceite mineral, cubra y almacene en hielo o a 4°C para su uso posterior.
2. Para cada conjunto de cuatro reacciones de secuenciación, mezcle los siguientes reactivos en un tubo de ensayo eppendorf:
(1) Reacción de muestra:
ADN plantilla de plásmido. : 2,1 pmol
tampón de secuenciación 5x: 5 ml
cebador: 4,5 pmol
El volumen final de ddHO estéril es de 16 ml.
(2) Reacción de control
ADN control PGEM-3Zf(+) (4 mg): 4,0 ml.
tampón de secuenciación 5x: 5 ml
cebador directo PUC/M13 (4,5 pmol): 3,6 ml.
3. Agregue 1,0 ml de ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación (5 μ/ml) a la mezcla de cebador/plantilla (paso 2 anterior). Pipetee unas cuantas veces para mezclar.
4. Pipetee 4 ml de la mezcla de enzima/cebador/plantilla del paso 3 y agréguelos al tubo de cada mezcla de d/ddNTP.
5. Centrifugar en una microcentrífuga de manera que toda la solución quede en el fondo del tubo eppendorf.
6. Colocar el tubo de reacción en un termociclador precalentado a 95°C e iniciar el programa de ciclo según el modo de ciclo intermedio. Se debe elegir la temperatura de recocido óptima para cada combinación de imprimador/plantilla. El siguiente programa normalmente puede leer una longitud de 350 bases de un cebador.
7. Una vez completado el programa del ciclo térmico, agregue 3 μl de solución de parada de secuenciación de ADN a cada tubo y gire en una microcentrífuga para finalizar la reacción.
Nota
La cantidad de ADN plantilla utilizada para (1) la secuenciación generalmente se agrega de acuerdo con los siguientes requisitos:
Tipo/longitud de plantilla Cantidad de plantilla p>
200 pares de bases (producto de PCR): 16 nanogramos (120 fmol)
3000~5 000 pb (ADN plasmídico superenrollado): 4 mg (2 pmol)
48.000 pares de bases (λ, ADN cósmido): 1 mg (31 fmol)
Los plásmidos superenrollados se utilizan como plantillas porque producen una señal más débil que el ADN bicatenario lineal relajado. La cantidad es mayor que otros. plantillas.
(2) La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de nanogramos de cebador equivalente a 4,5 pmol:
4,5 pmol=1,5 ng×n, donde n es el número de bases de imprimación.
La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de microgramos de cebador equivalente a 1p mol:
dsdna:1 pmol = (6,6×10mg)×n, donde n es el par de bases de la plantilla.
ADN ss: 1 pmol = (3,3×10mg)×n, donde n es el número de bases molde.
(3) Para evitar que la ADN polimerasa Taq extienda cebadores de hibridación no específicos, el ciclador térmico debe precalentarse a 95 °C. Los cambios de temperatura deben ser lo más rápidos posible. Los siguientes tiempos de ciclo no incluyen el tiempo de cambio de temperatura. Si no está seguro de qué modo utilizar, se recomienda comenzar con el modo 1.
Modo 1: Adecuado para imprimación
95 ℃ durante 2 minutos, luego: 95 ℃ durante 30 segundos (desnaturalización), 42 ℃ durante 30 segundos (recocido), 70 ℃ durante 1 minuto (extensión).
Modo 2: Adecuado para primers con contenido de GC ≥24 bases o ligeramente inferior al 50%.
95 ℃ durante 2 minutos, luego: 95 ℃ durante 30 segundos (desnaturalización), 70 ℃ durante 30 segundos (recocido/extensión).
(4) Después de añadir la solución de parada, la muestra se puede mantener a 4°C durante la noche.
3. Preparación de placas de gel de secuenciación
1. Manipulación de placas de vidrio
Las placas de vidrio para secuenciación teñidas de plata deben estar muy limpias. Generalmente, primero lave con agua tibia y detergente, luego use agua desionizada para eliminar el detergente restante y finalmente lave con etanol. Una micropelícula de detergente que quede en la placa de vidrio puede provocar un fondo alto (marrón) durante la tinción con gel. El gel se puede reticular químicamente sobre placas de vidrio cortas después del tratamiento con una solución adhesiva. Este paso es muy importante para evitar que el gel se rompa durante las operaciones de tinción con plata.
(1) Tratamiento de placas de vidrio cortas
① Agregue 5 ml de silano adhesivo a 1 ml de etanol al 95 % y ácido acético glacial al 0,5 % para preparar una nueva solución adhesiva.
② Limpie la placa de vidrio cuidadosamente limpiada y secada naturalmente con un paño absorbente empapado en una solución de pegamento recién preparada. Se debe limpiar toda la superficie de la placa.
③Después de 4 a 5 minutos, limpie la placa de vidrio en una dirección con etanol al 95% y luego límpiela verticalmente con un poco de fuerza. Repita este proceso de limpieza tres veces, utilizando cada vez un papel limpio para eliminar el exceso de solución adhesiva.
Nota
① Al limpiar la placa de vidrio con etanol al 95% en una dirección, una fuerza excesiva eliminará demasiado silano adhesivo, lo que provocará que el gel se adhiera mal.
② Cámbiate los guantes antes de preparar la placa de vidrio larga para evitar que el silano se adhiera y se adhiera.
③Es muy importante evitar que el pegamento contamine la placa de vidrio larga, de lo contrario el gel se romperá.
(2) Manipulación de placas de vidrio largas:
① Limpie las placas de vidrio largas con un pañuelo de papel empapado en solución de Sigmacote.
②Después de 5 a 10 minutos, limpie la placa de vidrio con papel de seda absorbente para eliminar el exceso de solución de Sigmacote.
Nota
① Remoje el gel usado en agua y raspe con una hoja de afeitar o un raspador de plástico. Los paneles de vidrio deben limpiarse a fondo con detergente. O sumérjalo en NaOH al 10% y retire el gel. Para evitar la contaminación cruzada, las herramientas utilizadas para limpiar láminas de vidrio cortas deben separarse de las herramientas utilizadas para limpiar láminas de vidrio largas. Si se produce contaminación cruzada, los geles preparados posteriormente pueden romperse o aflojarse.
2. Preparación del gel
(1) La placa de vidrio se puede fijar después de haber sido tratada con gel de sílice adhesivo y Sigmacote. En este método, se colocan tiras de borde de 0,2 mm o 0,4 mm de espesor en los lados izquierdo y derecho de la placa de vidrio y se presiona otra placa de vidrio encima. Inserte el borde plano del diente de tiburón en el costado de la placa de vidrio larga y asegúrelo con una abrazadera.
(2) Según la concentración de gel requerida, preparar el gel de secuenciación según la siguiente tabla. Generalmente, una concentración de gel del 6% al 8% puede lograr mejores resultados. Durante el proceso de preparación, disolver la urea con una cantidad adecuada de agua bidestilada, luego agregar ACR & Bis y tampón TBE 10×, luego ajustar el volumen final a 99,2 ml con agua bidestilada, filtrar con un filtro de 0,45 mm. y luego agregar persulfato de amonio y TEMED. No se requiere calentamiento para disolver la urea. Si realmente es necesario calentar, agregue TEMED y persulfato de amonio solo después de que la solución se haya enfriado por completo. Generalmente, la polimerización comienza de 4 a 6 minutos después de verter el pegamento. Si la polimerización no es buena, se deben utilizar altas concentraciones de TEMED y persulfato de amonio.
(3) Una vez preparado el pegamento, se puede verter la placa de goma. Generalmente, el gel se vierte lentamente en la ranura de la placa de vidrio a lo largo del borde de la capa y luego se deja reposar para que se complete la polimerización.
Nota
(1) Cuando utilice una abrazadera para fijar la placa de vidrio, es mejor utilizar una abrazadera un poco más fuerte para evitar fugas de pegamento debido a una resistencia insuficiente durante el proceso de llenado de pegamento. .
(2) Se debe evitar estrictamente la generación de burbujas de aire durante el proceso de llenado del gel, de lo contrario afectará los resultados de la secuenciación.
Cuarto, electroforesis
1. Preelectroforesis
(1) Una vez completada la polimerización del gel, saque el peine de dientes de tiburón y déle la vuelta. hacia abajo y se retiran los dientes. El extremo se inserta en el gel para formar un pocillo de muestra.
(2) Fije inmediatamente la placa de gel en el tanque de gel de secuenciación. Por lo general, los tanques superior e inferior del tanque de gel de secuenciación están separados, por lo que solo se puede agregar tampón después de fijar la placa de gel.
(3) Diluya el tampón 10×TBE a 1×TBE, agregue el tampón a los tanques de electroforesis superior e inferior, elimine las burbujas generadas, encienda la alimentación y prepárese para la preelectroforesis.
(4) Algunos tanques de electroforesis, como el Macrophor de LKB, se calientan mediante un baño de agua, por lo que el baño de agua debe calentarse a 55 °C antes de la preelectroforesis. Algunos no utilizan calentamiento por baño de agua, sino que dependen del calor generado por ellos mismos durante la electroforesis, como el tanque de electroforesis de secuenciación producido por Shanghai Qiujing Plexiglas Instruments. Este tanque requiere dos placas de aluminio que disipan el calor para mantener constante la temperatura de toda la placa de gel.
(5) Pre-electroforesis a 30 V/cm durante 20-30 minutos. El proceso de preelectroforesis consiste en eliminar los iones de impureza del gel y llevar la placa de gel a la temperatura requerida. La electroforesis a alta temperatura puede evitar que las regiones ricas en GC formen estructuras en horquilla y afecten los resultados de la secuenciación.
Nota
(1) Cuando utilice un peine con dientes de tiburón para hacer el orificio de muestreo, preste atención a la punta del diente que se insertará en el pegamento aproximadamente 0,5 mm. Asegúrese de tener en cuenta que el orificio de muestreo no puede tener fugas; de lo contrario, no se podrán obtener resultados correctos.
② Siempre preste atención a si el tampón en el tanque de electroforesis superior tiene fugas; de lo contrario, puede causar fácilmente un cortocircuito y dañar el instrumento de electroforesis.
2. Preparación de muestras
Durante la preelectroforesis, se pueden preparar las muestras. Las muestras reaccionadas se pueden calentar en un baño de agua hirviendo durante 1 a 3 minutos y colocar inmediatamente en hielo. . Si la muestra no se utiliza durante un largo tiempo, se debe reprocesar. Se puede utilizar un gel de poliacrilamida del 4 al 6 % con un espesor de 0,4 mm. Un espesor del pegamento inferior a 0,4 mm puede provocar que la señal sea demasiado débil. Al agregar una muestra, no es necesario aspirar el aceite mineral que cubre la capa superior, sino aspirar con cuidado la muestra azul debajo del aceite mineral.
3. Carga de muestra y electroforesis
Apague el instrumento de electroforesis, use una pipeta para absorber el tampón para limpiar bien la muestra, retire la urea difundida durante la preelectroforesis y luego inmediatamente. Utilice un inyector capilar. Aspire la muestra y agréguela al pocillo de muestra. El orden de adición de muestras es generalmente g, a, t, c. La electroforesis se realiza inmediatamente después de agregar muestras. La electroforesis se puede realizar a 30 V/cm al principio y se puede aumentar a 40 ~ 60 v/cm después de 5 minutos, manteniendo el voltaje constante. En términos generales, una placa de gel de 55 cm de largo y 0,2 mm de espesor puede llegar al fondo después de la electroforesis a un voltaje constante de 2500 V durante 2 horas. Durante el proceso de electroforesis, la corriente se puede reducir constantemente de 28 mA a 25 mA. Para leer secuencias más largas, se pueden utilizar dos o más rondas de carga.
Nota
① Al cargar muestras para electroforesis, asegúrese de prestar atención a si la temperatura de la placa de gel alcanza aproximadamente 55 °C. Si aún no, deberás esperar hasta que alcance la temperatura.
② En términos generales, no es aconsejable utilizar un voltaje demasiado alto durante la electroforesis, porque un voltaje demasiado alto reducirá la resolución del gel y hará que las bandas se extiendan. La electroforesis puede utilizar electroforesis de potencia constante.
V Tinción con Plata de Geles de Secuenciación
El proceso de tinción requiere sumergir el gel en un recipiente de plástico. Por lo tanto, utilice al menos dos platos que sean de tamaño similar a los platos de vidrio. Lave los platos con agua de alta calidad antes de agregarles una solución nueva.
1. Después de la electroforesis, utilice una lámina de plástico para separar con cuidado las dos placas. El gel debe quedar firmemente adherido a la placa de vidrio corta.
2. Fijación del gel: Coloque el gel (con placa de vidrio) en un recipiente de plástico, sumérjalo en la solución de fijación/parada y agite bien durante 20 minutos o hasta que el tinte de la muestra desaparezca por completo. Los geles se pueden almacenar en la solución fijadora/parada durante la noche (sin agitar). La solución Fix/Stop se utiliza para detener la reacción cromogénica.
3. Lavar el pegamento: lavar el pegamento 3 veces con agua ultrapura, 2 minutos cada vez. Sácalo del agua y transfiérelo a la siguiente solución. Sostén el borde de la placa de goma y déjalo reposar durante 10 a 20 segundos para que salga el agua.
4. Tinción en gel: Transfiera el gel a la solución de tinción y agite bien durante 30 minutos.
5. Revelado en gel
Agregue (1) formaldehído (3 ml) y solución de tiosulfato de sodio (400 μl) al revelador para completar la preparación del revelador.
(2) Saque el gel de la solución colorante, colóquelo en un recipiente lleno de agua ultrapura, déjelo en remojo y lávelo durante 5 a 10 segundos. Tenga en cuenta que el tiempo total para la transferencia del gel desde el agua ultrapura al revelador no debe exceder los 5 ~ 10 segundos. Si lo deja en remojo durante demasiado tiempo, la señal será débil o se perderá. Si el tiempo de remojo es demasiado largo, puedes repetir el paso 5 y remojar en la solución de tinte.
(3) Transfiera inmediatamente el gel a 1 litro (la mitad de la cantidad total) de cromógeno preenfriado, agítelo bien hasta que comiencen a aparecer las bandas plantilla o comience a aparecer el primer lote de bandas, y el gel se transfiere. Transfiera el gel al 1 litro restante de reactivo cromogénico y continúe desarrollando durante 2 a 3 minutos o hasta que aparezcan todas las bandas.
6. Gel fijador: Añade un volumen igual de solución fijadora/detención directamente al revelador. Detener la reacción de desarrollo y reparar el gel.
7. Remojar el gel en agua ultrapura dos veces durante 2 minutos cada vez. Tenga cuidado de usar guantes y sujetar el borde de la placa adhesiva para evitar dejar huellas dactilares en el pegamento durante esta operación.
8. Secar el gel a temperatura ambiente, o bombeando aire y calentando. Vea el gel en una caja de luz visible o sobre un fondo blanco y amarillo brillante, como papel. Si se requieren registros permanentes, se puede utilizar una película EDF para guardar los resultados experimentales.
Nota
La tinción con plata de productos de secuenciación es un nuevo método para revelar información de secuencia. El éxito o el fracaso de este sistema se ve afectado por muchos factores.
① La calidad del agua es extremadamente importante para el éxito del teñido. El agua ultrapura (NANOpureR o Milli-QR) o el agua bidestilada pueden lograr buenos resultados. Si hay impurezas en el agua es posible que no aparezcan bandas de bajo peso molecular.
②El carbonato de sodio también es muy importante.
Es mejor utilizar carbonato de sodio fresco, de grado de la American Chemical Society, como carbonato de sodio de grado reactivo ACS de Fisher y Kodak (Catálogo Fisher #S263-500 o S262-3, o Catálogo Kodak #109-1990), que generalmente está disponible. resultados.
③El paso de lavado después de teñir es muy importante. Si el gel se lava durante demasiado tiempo, las partículas de plata se separarán del ADN, lo que dará como resultado poca o ninguna señal de secuencia. Si el lavado tarda demasiado, puedes repetir el paso de teñido.
④ Si el espesor del gel supera los 0,4 mm o la concentración de acrilamida es superior al 4 ~ 6%, es necesario ampliar el tiempo de fijación y tinción. Si el gel tiene un espesor inferior a 0,4 mm, el lavado después de la reacción de tinción debe acortarse a no más de 5 segundos.
⑤Excepto la reacción de color, todos los pasos se realizan a temperatura ambiente. El revelador debe enfriarse previamente a 10 ~ 12 °C para reducir el ruido de fondo. Nota: Agregue formaldehído y tiosulfato de sodio al revelador antes de usarlo. Utilice soluciones de tinción y revelado recién preparadas. No reutilice ninguna solución.
Sexto, revelado de película EDF
El uso de membrana EDF puede mejorar el contraste de las bandas de secuenciación. Si las bandas del gel de secuenciación son muy superficiales, recomendamos transferir los datos a una película EDF. Los geles teñidos con plata pueden mejorar la legibilidad de las tiras después de que sus imágenes se transfieran a una película EDF.
1. En el cuarto oscuro, coloca el gel teñido (con el lado del pegamento hacia arriba) sobre la caja fluorescente. También puedes utilizar una caja de luz blanca si tienes un difusor adecuado. Para garantizar el tiempo de exposición, utilice un pequeño trozo de película EDF para exponer en diferentes momentos y comprobar las diferentes intensidades de exposición. Generalmente con una exposición de 20 a 40 segundos se pueden conseguir mejores resultados.
2. Encuentre la esquina que falta de la membrana EDF bajo luz roja y luego coloque la membrana sobre el gel de modo que el espacio quede en la esquina superior izquierda. Dado que la película EDF es de una sola cara, debe asegurarse de que el espacio esté en la esquina superior izquierda.
3. Coloque una placa de vidrio limpia y seca sobre la película EDF y encienda la caja de luz durante unos 20 segundos.
4. Revelar manualmente la película EDF mediante el revelado de película autorradiográfica. Se pueden utilizar los siguientes procedimientos operativos:
(1) Revelar en revelador Kodak GBX durante 1 a 5 minutos;
(2) Lavar con agua durante 65438±0 minutos; p>
(3) Fijar en fijador Kodak GBX durante 3 minutos
(4) Lavar con agua durante 1 minuto;
Nota
① El gel debe estar completamente seco antes del revelado de la película EDF. Utilice guantes para evitar huellas dactilares. Al mismo tiempo, cabe señalar que las máquinas reveladoras automáticas de películas no se pueden utilizar para películas EDF.
②El tiempo de exposición óptimo de diferentes fuentes de luz puede ser diferente. Elija el mejor tiempo de exposición para la fuente de luz que está utilizando exponiendo un pequeño trozo de película EDF en diferentes momentos. Consulte el manual de la película.
③Un tiempo de exposición corto hará que la imagen de la película EDF sea más profunda y un tiempo de exposición prolongado ayudará a debilitar el fondo. "Shotgun" es un método para extraer genes objetivo del genoma de un organismo. Primero, el ADN cromosómico de las células biológicas se corta en muchos fragmentos a nivel genético mediante métodos físicos (como fuerza de corte, ultrasonido, etc.). ) o métodos químicos enzimáticos (como endonucleasas de restricción), luego combine estos fragmentos con vectores apropiados, transfiera el ADN recombinante a la bacteria receptora para su amplificación y obtenga una biblioteca de genes propagados clonalmente. Luego, en combinación con métodos de detección, se seleccionan cepas que contienen un determinado gen entre muchas cepas transformantes y se aísla y recupera ADN recombinante de ellas.
Este método consiste en aislar el gen objetivo mediante tecnología de ingeniería genética. Su característica es evitar la dificultad de aislar directamente el gen y seleccionar el gen objetivo de la biblioteca de ADN genómico. Se puede decir que se trata de utilizar el principio de "disparo de escopeta" para "golpear" un gen. Debido a que los genes objetivo son muy pocos y demasiado pequeños en todo el genoma, depende en gran medida de la "suerte", por lo que la gente llama a este método experimento de "escopeta" o "escopeta".
1. Utilice endonucleasa de restricción para cortar el ADN insertado grande del fragmento diana y recuperarlo mediante electroforesis en gel de agarosa.
En segundo lugar, utilice métodos físicos (como ultrasonido, etc.) para cortar los grandes fragmentos de ADN recuperados. ), y luego use la ADN polimerasa t 4 para suavizar los extremos de los pequeños fragmentos de ADN.
En tercer lugar, realice electroforesis en agarosa y recupere pequeños fragmentos de ADN de 1 kpb ~ 2 kpb mediante escisión en gel. Luego use BcaBestDNA Polymerase para agregar una base A al extremo 3' del ADN.
En cuarto lugar, el fragmento de ADN con la cola A añadida se liga al vector T, seguido de la transformación y la clonación.
5. Secuenciación de ADN de clones positivos (incluido el inserto de 1 kpb ~ 2 kpb).
En sexto lugar, edite los datos y finalmente conéctelos en una secuencia de ADN grande.