Aplicación de la tecnología FISH
Esta tecnología no sólo puede utilizarse para la localización cromosómica de genes o secuencias conocidas, sino también para el estudio de genes no clonados o marcadores genéticos y aberraciones cromosómicas. Tiene ventajas considerables en la investigación sobre caracterización, cuantificación, integración y expresión de genes.
El desarrollo y progreso de la tecnología de hibridación fluorescente in situ (FISH)
La tecnología FISH muestra que los ácidos nucleicos se mejoran a partir de sondas marcadas con isótopos. No existía un método de etiquetado especializado para el etiquetado isotópico temprano, como agregar bases aleatorias marcadas con isótopos a las células en crecimiento seguido de una autorradiografía. Las numerosas deficiencias de la hibridación de isótopos requerirán inevitablemente una mejor tecnología para reemplazarla. En primer lugar, los materiales radiactivos determinan la inestabilidad de la sonda, especialmente los isótopos con vidas medias cortas que continúan desintegrándose con el tiempo, haciendo que la actividad de la sonda sea insostenible. En segundo lugar, aunque la radiografía es extremadamente sensible, su resolución (nitidez) es limitada. En tercer lugar, para obtener señales detectables en películas radiográficas, a menudo es necesario ampliar el tiempo de exposición, lo que prolonga el ciclo de detección. En cuarto lugar, las sondas radiomarcadas son relativamente caras y los materiales radiactivos deben transportarse, almacenarse y manipularse según procedimientos estrictos. La tecnología FISH se ha mejorado significativamente en términos de resolución, ciclo de detección y seguridad, y ha sentado las bases para la futura detección multisitio, análisis de alta calidad y mapeo de células vivas.
En 1980, Bauman utilizó por primera vez la hibridación fluorescente in situ para la detección de ácidos nucleicos, marcando directamente el extremo 3' del ARN con fluoresceína como sonda para secuencias específicas de ADN. Los métodos de base marcada con fluoresceína conjugada con enzima incrustados en toda la sonda se han utilizado ampliamente en la preparación de sondas fluorescentes que pueden marcarse un color a la vez; La tecnología de base marcada con aminoalilo se puede combinar con cualquier hapteno o fluoresceína, lo cual es crucial para la hibridación in situ porque la tecnología de base marcada con aminoalilo se puede utilizar mediante una reacción química simple. Se obtienen una serie de sondas de señal de fondo baja y se inicia la hibridación. La señal se amplifica a través del sistema de detección secundario de la sonda de hibridación. Ya en la década de 1880, se utilizaban métodos como la detección de traducción de mella, sondas marcadas con biotina y detección secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para la detección de ADN y ARNm. Unos diez años más tarde, la síntesis de sondas de ADN monocatenario y la mejora continua de los métodos de etiquetado permitieron que las sondas de hibridación sintetizadas transportaran una gran cantidad de moléculas de fluoresceína para la detección directa. Sobre la base de estos métodos, existen muchos informes sobre mejoras directas o indirectas en diferentes rangos de detección, especificidades, sensibilidades y resoluciones.
1 El desarrollo del número de sitios de detección y objetivos de detección de la tecnología FISH
Después del establecimiento básico de la tecnología FISH, FISH no solo se utiliza para la detección de un solo gen o ácido nucleico, pero el mayor desarrollo de la tecnología FISH se extiende al FISH multicolor que detecta simultáneamente múltiples sitios genéticos y se ha desarrollado desde la detección de genes hasta la detección in situ de ARNm de productos de transcripción en genomas, cromosomas, células vivas y detección de ácidos nucleicos a nivel de tejido. En futuras investigaciones, también se podrá aplicar a la detección de todo el organismo. Las primeras sondas eran más grandes y se prepararon mediante propagación de vectores, traducción de mellas, transcripción in vitro y síntesis de ADN con cebadores aleatorios para obtener clones híbridos específicos. Sin embargo, las sondas de fragmentos grandes generalmente contienen secuencias repetitivas que dan como resultado un fondo de alta fluorescencia, el tratamiento previo con ácidos nucleicos no marcados para unirse a sitios no específicos para inhibir la hibridación no específica puede superar los problemas anteriores y también permite a los investigadores expandir el objetivo de detección. la tinción de todo el cromosoma. En citogenética, la tecnología FISH también se ha mejorado significativamente en el análisis de cromosomas. Por ejemplo, la hibridación genómica comparativa se utiliza para detectar deleciones y duplicaciones en regiones cromosómicas. Una vez que la sonda del fragmento grande se une de manera no específica a la muestra, formará una señal que confundirá la detección de genes en el cromosoma, por lo que debe cortarse en pequeños fragmentos de <200 nucleótidos. Hoy en día, la mejora de los métodos de detección y el desarrollo continuo del software de detección han hecho que los requisitos de detección de la tecnología FISH sean cada vez más bajos, y la sensibilidad sea cada vez mayor. La mejora continua de los algoritmos precisos de procesamiento de imágenes por computadora ha dado como resultado una tecnología de alta resolución para sondas a nivel submicroscópico. A medida que los objetivos de detección se vuelven cada vez más pequeños, la tecnología FISH se ha utilizado para reordenamientos crípticos de genes del cariotipo subtelomérico y mapeo cromosómico preciso y detección de ARNm de copia única.
La expansión del alcance de la detección de FISH provocó que la aplicación de la tecnología FISH creciera rápidamente en la década de 1990. La rama tecnológica formada por la aplicación de la tecnología FISH permite la detección simultánea de cada vez más tipos diferentes de loci. En primer lugar, se utilizan diferentes fluoróforos para detectar múltiples sitios. Por ejemplo, se utiliza fluorescencia de dos colores para detectar secuencias de ácido nucleico específicas. Cada cromosoma, gen o transcrito está representado por una señal fluorescente distinguible. Posteriormente, se adoptaron dos esquemas de decodificación de colores para ampliar aún más el ámbito de aplicación de FISH. El esquema de decodificación representa principalmente múltiples sitios con respecto a la proporción de colores, es decir, la proporción de cada color en el color total. Cada uno de los métodos antes mencionados, o una combinación de los dos métodos, ha permitido hasta 12 sitios detectables. El esquema de cinco colores que utiliza traducción por computadora puede detectar simultáneamente todos los cromosomas humanos, lo que representa un hito en la detección de múltiples locus de la tecnología FISH. Aunque los ARNm se pueden observar utilizando una variedad de métodos, el análisis in situ de transcripciones completas mediante FISH parece ser más prometedor.
La tecnología de decodificación de colores ha permitido la detección de tejidos completos.
2 Etapa de análisis cuantitativo de la tecnología FISH
Pinkel et al. (1986) utilizaron por primera vez el análisis cuantitativo de imágenes de fluorescencia para la detección citogenética básica, utilizando una cámara con un dispositivo de bloqueo de excitación de doble color para detectar señales de fluorescencia y rápidamente se adoptaron técnicas de análisis cuantitativo para la detección de ARNm. La clave para la detección de fluorescencia es la reproducibilidad, la irregularidad de la señal y la autofluorescencia del fondo. No sólo diferentes muestras tienen diferente fluorescencia, sino que los materiales en el mismo portaobjetos o en las mismas células pueden mostrar una fluorescencia desigual. Actualmente existe una variedad de métodos utilizados para eliminar la autofluorescencia en algunos tejidos: por ejemplo, durante el proceso de preparación de la muestra, los reactivos de eliminación de la autofluorescencia utilizados incluyen borohidruro de sodio o pretratamiento con radiación luminosa para eliminar señales de fondo no específicas. Estos métodos para eliminar la autofluorescencia no son del todo efectivos y la señal de autofluorescencia a menudo se elimina mediante aritmética informática al realizar el análisis de imágenes. Los datos espectrales de la imagen de fluorescencia, que incluyen la señal verdadera y mucho ruido, se analizan por separado y los datos de ruido se eliminan analizando los componentes espectrales individuales. Multicolor FISH tiene sus propias limitaciones, incluidas las diferentes intensidades de fluorescencia y la superposición de colores. Pero las imágenes multicolores se equilibran mediante análisis de algoritmos informáticos, que incluyen cambios de intensidad y corrección automática de la superposición de señales.
Las limitaciones de las imágenes FISH en sí no han afectado al desarrollo de algoritmos de descifrado automático. El uso de sondas de secuencia más grandes para la detección de sitios de ADN y algoritmos de conteo de fluorescencia multicolor ayuda a los patólogos a lograr análisis automatizados. Además, la aplicación de kits de sondas de detección y métodos de conteo puntual proporciona una plataforma para obtener resultados de detección convenientes. Aunque se han utilizado diversos métodos para analizar u optimizar los sistemas automatizados de detección de células, la detección citopatológica manual sigue siendo el método más fiable para el análisis de tejidos. Sin embargo, la alta eficiencia de la preparación celular, la identificación y la detección computarizada de muestras celulares en medios fijos no puede ignorarse en el futuro diagnóstico médico. La detección rápida de señales moleculares intracelulares solo podrá detectarse mediante métodos asistidos por computadora. Ahora, los procedimientos de detección automatizados se han ampliado para utilizar modelos de transcripción multigénica para detectar grupos de ADN y sitios de transcripción específicos para determinar el estado de las células funcionales.
Dado que el desarrollo inicial de FISH se centró principalmente en la expansión de tipos de sondas y sitios de detección, el desarrollo futuro de la tecnología de detección de fluorescencia puede incluir la expansión de los campos de detección. La aplicación de diagnóstico clínico de imágenes de fluorescencia requiere mejoras adicionales en el sistema de detección, como la combinación de sondas, la automatización de la fotografía y el análisis, para evitar errores entre diferentes operaciones. El espesor de la muestra es un factor limitante en los tipos de muestras examinadas con microscopía de fluorescencia. La microscopía de enfoque láser reciente y la tecnología de tomografía óptica de rayos X requieren un espesor de muestra de 1 a 2 mm. Una técnica mejorada de microtomografía de rayos X de proyección óptica puede adquirir imágenes de muestras de hasta 15 mm de espesor, ampliando el rango de detección de muestras biológicas y de diagnóstico. También se ha informado de la detección de ARN en células vivas con tecnología FISH. Para la detección se puede utilizar el grupo fluorescente liberado in vivo o la fluoresceína de la sonda hibridada. Ambos métodos nuevos pueden reducir el alto nivel de fondo en presencia de sondas marcadas no específicas (como células vivas) y pueden usarse para rastrear las vías de síntesis y transferencia de ARNm. Estos métodos son más fáciles de detectar diferentes moléculas objetivo que la proteína verde fluorescente (GFP). En comparación con la detección de hibridación in situ de células vivas GFP, FISH es susceptible a la influencia de sondas sintéticas intracelulares. FISH necesita mejoras adicionales para reducir el fondo de interferencia durante la detección de la expresión genética in vivo y evitar la interferencia de las autohibridaciones intracelulares. De hecho, no es necesario considerar la diferencia entre la detección de FISH y la tecnología de detección de proteínas fluorescentes. La combinación de la tecnología de FISH y la tecnología de proteínas fluorescentes puede detectar ácidos nucleicos y proteínas diana al mismo tiempo.
La aplicación de la tecnología de microscopía multifotónica ha ampliado aún más el ámbito de aplicación de las imágenes de fluorescencia. Con la microscopía multifotónica, el bloque láser puede emitir fotones enfocados en el microscopio dos o tres veces para excitar el fluoróforo de interés. El uso de luz de excitación del infrarrojo cercano puede penetrar muestras biológicas a un nivel más profundo y es menos tóxico para las muestras vivas que la luz visible. La aplicación de este nuevo método ha permitido utilizar imágenes de fluorescencia para la detección de sistemas vivos e incluso animales completos. Dado que aún no se pueden sintetizar sondas de marcado biológico, la aplicación actual de imágenes de fluorescencia en organismos vivos se limita a la detección de moléculas fluorescentes o autofluorescencia biológica. La señal de autofluorescencia producida por los tejidos biológicos durante procesos fisiológicos o fisiopatológicos normales puede utilizarse como una señal de diagnóstico importante. Una vez que las sondas biológicas sean posibles, se convertirán en un poderoso medio auxiliar para identificar secuencias de ácidos nucleicos específicas, realizar diagnósticos no invasivos y obtener imágenes de diagnóstico.