En la historia de la ciencia, ¿qué experimentos se utilizaron para demostrar que el ADN es material genético?
Streptococcus pneumoniae incluye bacterias patógenas tipo S (lisas, por el aspecto liso de las colonias) y bacterias no patógenas tipo R (rugosas, por el aspecto rugoso de las colonias) con cápsulas de polisacáridos. . Las cápsulas tienen diferentes estructuras y se pueden dividir en tipo I, tipo II y tipo III según la respuesta inmune. Si una bacteria tiene la capacidad de producir cápsulas y el tipo de cápsula producida son "firmas genéticas". Las bacterias tipo S pueden producir mutantes R mediante mutación y viceversa, pero las mutaciones siempre implican perder o ganar la capacidad de producir un tipo específico de cápsula (por ejemplo, II-S?6?2II-R; no III-S?6?2II - R).
Durante 1928, el Dr. Frederick Griffiths (1879-1941), que trabajaba en el Departamento de Salud británico, estudió la patogenicidad de las bacterias neumocócicas. Cuando inyectó una mezcla de bacterias tipo S tratadas térmicamente (tipo III-S) y bacterias vivas tipo R (tipo II-R) en ratones, los ratones murieron, ¡aunque ninguna de las bacterias era letal! Es más, las bacterias tipo S se aislaron de ratones que murieron después de ser inyectados con esta mezcla, y son del mismo tipo S (III-S) que las bacterias tipo S muertas por calor, por lo que estas bacterias tipo S no puede ser mutado por estas bacterias específicas de tipo R. Griffith llamó principio de transformación a esta sustancia desconocida que provocó la transformación. No conocía la naturaleza del principio de transformación, pero supuso incorrectamente que podría ser una proteína involucrada en la síntesis de las cápsulas, o alguna sustancia que sirviera como precursora de las cápsulas bacterianas.
Diferentes científicos han dado tres explicaciones para este experimento:
1 Las bacterias de tipo R de alguna manera "resucitaron" bacterias de tipo S muertas por calor;
2 ( Nueva teoría lamarckiana) Las bacterias muertas de la cepa III-S estimularon a los ratones a producir sustancias inmunes, y las sustancias inmunes estimularon a la cepa II-R a mutar en la cepa III-S (hasta 1958, todavía había libros de texto que consideraban el experimento de transformación neumocócica como Este es un ejemplo de inducción dirigida de la teoría neo-lamarckiana);
El material genético de las bacterias de tipo III-S ingresa a las bacterias de tipo II-R y sintetiza la cápsula de las bacterias de tipo III-S.
En la década de 1930, los genetistas estudiaban principalmente las moscas de la fruta, pero no estaban interesados en la herencia de las bacterias. Los inmunoquímicos están interesados en esta cuestión.
En 1931, Martin Henry Dawson y Richard H.P. Sia llevaron a cabo con éxito un experimento de transformación in vitro: sólo las bacterias II-R se transformaron en bacterias III-S en una placa de Petri y no se necesitaron ratones como cultivo. medio. Esto niega la explicación neolamarckiana de que las sustancias inmunes se inducen en ratones.
En 1933, Lionel J. Alloway mezcló extractos libres de células de bacterias tipo II-R y bacterias tipo III-S (eliminando todas las células intactas, restos celulares y moléculas de cápsulas), bacterias tipo III-S todavía crecía en la placa de Petri. Esto niega que las bacterias tipo R de alguna manera "resucitaran" a las bacterias tipo S que habían sido eliminadas por el calor.
Por tanto, se concluye que los extractos celulares de bacterias tipo S contienen factores de transformación cuyas propiedades químicas aún se desconocen.
Griffith es una persona discreta y pragmática. La única vez que asistió a una conferencia académica fue a una conferencia de microbiología en 1936, y sus amigos se lo llevaron a rastras. Dio un informe superficial en la reunión. Su informe no tuvo nada que ver con sus famosos experimentos de transformación neumocócica en 1928, ya que no se dio cuenta de la importancia de sus experimentos de transformación en ese momento. En 1941, Griffiths y sus colegas murieron en el laboratorio durante un ataque aéreo nazi alemán en Londres. ) (En 1913, la madre de Avery murió de neumonía. A la edad de 36 años, el introvertido Avery decidió convertirse en bacteriólogo y estudiar la neumonía.
)
De 1935 a 1944, después de 10 años de investigación continua, tres inmunoquímicos Avery del Instituto Rockefeller de Estados Unidos (Oswald Theodore Avery, 1877.10.21 -1955.2.2), Macleod, 1909.1.28 -65448
El experimento de Avery en realidad no consistió en "agregar ADN, proteínas y vainas purificadas al medio de cultivo de bacterias tipo R" Polisacáridos de membrana, se descubrió que las bacterias tipo R se pueden transformar en tipo S bacterias sólo añadiendo ADN."
El trabajo de Avery y otros es en realidad eliminar continuamente varios componentes en las bacterias tipo S y luego obtener el "factor de transformación" purificado, luego identificar el "factor de transformación" purificado y confirmarlo como ADN; . No es como lo que dice el libro de texto People's Education Edition: purificar varios componentes de bacterias tipo S y luego usar los componentes purificados para realizar experimentos de transformación.
Cuanto mayor sea la pureza del ADN en el factor de transformación, mayor será la eficiencia de transformación; cuando el factor de transformación se trata con desoxirribonucleasa, no tiene función de transformación. Sin embargo, incluso si el factor de transformación se trata con proteasa, la eficiencia de transformación no se reduce.
En 1944, cuando Avery y otros extrajeron el ADN "más puro", todavía había un 1% de impureza proteica. En 1949, el ADN purificado por Rollin Hotchkiss contenía sólo un 0,02% de impurezas de aminoácidos (investigaciones posteriores demostraron que estos aminoácidos se generaban mediante reacciones bioquímicas de los nucleótidos después de la degradación del ácido nucleico, en lugar de los aminoácidos que anteriormente formaban las proteínas). Todavía existe la capacidad de transformarse. Rollin Hotchkiss también demostró que los rasgos bacterianos no relacionados con las cápsulas también pueden transformarse.
De hecho, los experimentos de Avery han demostrado rigurosamente que el ADN es material genético. Sin embargo, debido a las limitaciones del entorno científico de la época, sus resultados fueron criticados y no aceptados.
Los oponentes en ese momento tenían principalmente tres puntos de vista:
Limitado por la hipótesis del "tetranucleótido", creía que el contenido de las cuatro bases era el mismo y que el ADN era Un polímero simple de tetranucleótidos, así como el almidón es un polímero de glucosa, es poco probable que el ADN sea el material genético con información genética compleja.
Se cree que el ADN no era muy puro en los experimentos de transformación, y Protein Magazine cree que pueden ser estas pequeñas cantidades de proteínas especiales las que desempeñan un papel de transformación. En aquella época, era difícil para la gente olvidar la dolorosa lección del famoso bioquímico Richard Martin Willst (1872. 8. 13-1942. 8. 3) quien afirmó falsamente que las enzimas no eran proteínas porque no podían purificarse; /p>
Se cree que incluso si el factor de transformación es efectivamente el ADN, es posible que el ADN solo tenga un papel químico directo en la formación de la cápsula en lugar de servir como portador de información genética.
En 1952, Hershey (1908. 12.4–1997. 5. 22) y Chase (1927. 8. 8–2003.
Antes del experimento, conocían la infección por fagos. comienza con la unión del fago a la bacteria y termina con la lisis de la bacteria infectante y la liberación del fago descendiente no está claro, pero el material genético del fago, sea cual sea, debe ingresar a la bacteria.
El fago T2 está formado por ácido nucleico y cápside proteica. El ácido nucleico es la única sustancia que contiene fósforo y la cápside proteica es la única sustancia que contiene azufre. Primero se cultivan en medio fosfato que contiene P32 y sulfato. medio que contiene S35. coli, y luego infectar E. coli con fago T2, obteniendo así fagos con ácido nucleico marcado con P32 y cápsides de proteína marcadas con S35, respectivamente.
Infectar E. coli común con el fago marcado. fago y centrifugar durante un período de tiempo. Finalmente, se midió la radioactividad del sobrenadante y el sedimento después de la centrifugación.
Este experimento también se llama experimento del mezclador, porque la agitación y la centrifugación son los pasos clave del experimento. A través de la centrifugación, el fago ingresa a las células bacterianas y no lo hace. La fracción que ingresa a la célula puede verse obligada a separarse. Si no se agita o se agita durante mucho tiempo, el fago T2 se replicará, lisará la E. coli y. De esta manera, no habrá diferencia entre el "gránulo" y el "sobrenadante", y se perderá la radiactividad de detección.
En este momento, se encontró. que el 75% del S35 estaba marcado en el sobrenadante y el 25% en el sedimento.
(Unos años más tarde, se demostró que el 25% del S35 todavía unido a las bacterias consistía principalmente en fragmentos de cola asociados a fagos que se adherían demasiado a las superficies bacterianas y no podían eliminarse mediante agitación).
En ese momento, se descubrió que después de agitar, el 85% del P32 en el sedimento todavía estaba unido a las bacterias y solo el 15% del P32 se encontraba en el sobrenadante. Se cree que aproximadamente 1/3 de la radiactividad del sobrenadante es causada por la ruptura de las bacterias durante la agitación. Unos años más tarde, la investigación demostró que los dos tercios restantes eran causados por partículas de fagos defectuosas adheridas a bacterias que no podían inyectar su ADN. )
Más importante aún, se detectó P32 en fagos de progenie generados a partir de fagos marcados con P32. Sin embargo, entre la progenie de fagos producida por fagos marcados con S35, la radiactividad (según el artículo experimental original) es inferior al 1%.
Debido a que no todos los aminoácidos que forman las proteínas contienen azufre (el azufre solo puede marcar metionina y cisteína), este experimento no puede confirmar si existen proteínas libres de azufre y sin etiquetar que ingresan a las células y ejercen efectos genéticos. . Por tanto, no es tan riguroso y preciso como el experimento de Avery.
(Este experimento inspiró el pensamiento de los virólogos y propuso el proceso de reproducción del virus. El material genético (ADN) y el material no genético (proteína) se pueden separar primero y luego combinar.)
Sin embargo, debido a que la comunidad científica de aquella época había aceptado en general la opinión de que las proteínas no eran material genético, y la investigación sobre el ADN también era muy activa, el grupo de los fagos tuvo un gran impacto en el campo de la biología molecular, por lo que Hershey- Experimento Chase Es ampliamente aceptado e incluso utilizado como prueba final de que el ADN es el material genético. El experimento de Avery a menudo se ignora deliberadamente, hasta el punto de que algunos libros de texto incluso enumeran el experimento de Hershey Chase como el único experimento que demuestra que el ADN es el material genético. Más tarde, ante la fuerte insistencia de los colegas de Avery, se añadió una introducción al experimento de Avery.
Experimentos posteriores con el fago Phi X 174 separaron el virus en dos partes: ADN y cápside proteica. Sólo el ADN del virus es infeccioso, pero la cápside proteica del virus no lo es. Esto confirmó de manera concluyente que el ADN es el material genético.
En 1969, Hershey y Delbruck (Max Ludwig Henning Delbruck, 1906. 9. 4–1981. 3. 9) y Salvador Luria (1912). Los dos últimos también son miembros del grupo de los fagos. Hicieron una clásica "prueba de vacilación" en 1943, también conocida como prueba de ondas o prueba de ondas. Este experimento demuestra que la resistencia de E. coli a los fagos surge de forma aleatoria y espontánea durante la división celular antes de la exposición al fago correspondiente, en lugar de ser inducida por el fago. Los fagos sólo sirven para eliminar las bacterias susceptibles no mutadas originales e identificar mutantes resistentes. Por tanto, la mutación de un determinado rasgo no se corresponde con factores ambientales, lo que afirma aún más la teoría de Darwin y niega el neolamarckismo.