¿Clasificación y uso de microscopios?
Pozo salado
Microscopio
Microscopio
Un instrumento o dispositivo que utiliza un gran aumento para magnificar objetos pequeños o partes pequeñas de objetos para observación. Es ampliamente utilizado en la producción industrial y agrícola y en la investigación científica. Los biólogos y trabajadores médicos suelen utilizar microscopios en su trabajo. Se puede dividir a grandes rasgos en microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
Un microscopio óptico es un microscopio que utiliza luz visible como fuente de luz. Los microscopios ópticos comunes se pueden dividir en dos partes: sistema óptico y dispositivo mecánico. El sistema óptico incluye principalmente oculares, lentes objetivos, condensadores, diafragmas y fuentes de luz. El dispositivo mecánico incluye principalmente el cilindro de la lente, la columna del espejo, la platina, el soporte de la lente, el tornillo de ajuste del espesor y otras partes (Figura 1 [Microscopio óptico]). Su principio óptico básico se muestra en la Figura 2 [Modelo de principio de obtención de imágenes de microscopio óptico], en la que la pequeña lente convexa de la izquierda representa un grupo de lentes con una distancia focal más corta, llamada lente objetivo. La gran lente convexa de la derecha representa un conjunto de lentes de longitud focal larga llamados oculares. El objeto que se observa (AB) se encuentra ligeramente fuera del punto focal (F) de la lente del objetivo. Después de que la luz del objeto pasa a través de la lente del objetivo, forma una imagen real ampliada invertida (BA) ligeramente dentro del foco del ocular (F). Los ojos del observador amplían aún más la imagen real (BA) hasta convertirla en una imagen virtual invertida (BA) a través del ocular.
El ocular está situado encima del cilindro del microscopio y normalmente consta de dos lentes convexas. Además de ampliar aún más la imagen real formada por la lente del objetivo, también limita el campo de visión del ojo. Según el aumento, existen tres oculares de uso común: 5x, 10x y 15x.
La lente del objetivo suele estar situada debajo del cilindro del microscopio, cerca del objeto que se observa. Compuesto por 8 ~ 10 lentes. Su función es amplificar (producir una imagen real ampliada de un objeto), garantizar la calidad de la imagen y mejorar la resolución. Las lentes de objetivo comunes se pueden dividir en lentes de objetivo de bajo aumento (4x), aumento medio (10x o 20x), alto aumento (40x) y lentes de objetivo de inmersión en aceite (100x). Múltiples lentes de objetivo están integradas juntas en el cambiador de lentes y el plato giratorio se puede girar según sea necesario para seleccionar lentes de objetivo con diferentes aumentos.
El aumento de un microscopio es el aumento del ocular multiplicado por el aumento de la lente objetivo. Si el ocular es de 10x y la lente del objetivo es de 40x, el aumento es de 40×10x (el aumento es de 400x). Un microscopio excelente puede aumentar 2000 veces y resolver dos puntos separados por 1 × 10 cm.
Cuando la luz blanca pasa a través de una lente convexa, la luz con longitudes de onda más cortas (azul-violeta) se refracta mayor que la luz con longitudes de onda más largas (rojo-naranja). Entonces, al tomar imágenes, aparecen varios espectros alrededor de la imagen, con un círculo de brillo azul o rojo. Este defecto de color se llama aberración cromática. Debido a que la luz entra (sale) del espejo de la lente en diferentes ángulos, el ángulo de refracción de la luz que pasa a través de la periferia de la lente es mayor que el ángulo de refracción a través del centro de la lente. Por lo tanto, aparecen imágenes borrosas y distorsionadas alrededor de la imagen durante la toma de imágenes. Este defecto en la superficie de la imagen se llama aberración esférica. Una serie de grupos de lentes convexos y cóncavos de diferentes formas, estructuras y distancias trabajan juntos para corregir la aberración cromática y la aberración esférica al máximo, formando imágenes brillantes, claras y precisas. Por este motivo, el ocular o el objetivo consta cada uno de un conjunto de lentes. Este tipo de lente se llama plan acromática.
Cuando la luz se proyecta desde un medio (como el aire) hacia otro medio más denso (como el vidrio), se doblará hacia lo "normal" (la línea perpendicular a la interfaz del medio), como se muestra en Figura 3 [cuando la luz atraviesa la lente del objetivo]. La luz se desvía de lo "normal" cuando pasa de un medio denso (vidrio) a un medio no denso (aire). Por ejemplo, cuando la línea AOB (Figura 3a) ingresa al aire a través del condensador (índice de refracción: 1,51), se desviará y refractará hacia afuera. Por lo tanto, la cantidad de luz que ingresa a la lente del objetivo se reduce considerablemente y la resolución de. la imagen también se reduce. Cuando se utiliza una lente de objetivo de 100x, si se llena aceite (el índice de refracción también es 1,51) entre la lente del objetivo y el cubreobjetos para aislar el aire, la luz puede entrar en la lente del objetivo casi sin refracción, aumentando el brillo y la resolución de la imagen. Este tipo de objetivo se denomina objetivo de inmersión en aceite (Figura 3b).
El condensador está ubicado debajo de la platina del microscopio. Puede condensar la luz emitida por la fuente del ojo y concentrarla en la muestra para que la muestra esté iluminada uniformemente y la intensidad de la luz sea moderada. El extremo inferior del condensador está equipado con un diafragma de apertura (apertura) para controlar el espesor del haz.
La fuente de luz de un microscopio óptico común se encuentra debajo del condensador. El condensador es una bombilla de luz fuerte especial con iluminación uniforme y está equipada con una resistencia variable que puede cambiar la intensidad de la luz.
Debido a que la luz emitida por la fuente de luz de un microscopio óptico común se transmite hacia arriba desde la parte inferior del espejo, pasa a través del condensador y la lente objetivo y llega al ocular, es necesario cortar el muestra observada en una rebanada delgada transmisora de luz de aproximadamente 6 m de espesor y teñida para mostrar diferentes estructuras finas de tejidos, células, etc. Todo el proceso de procesamiento se denomina tecnología de corte de tejido convencional, que incluye la selección de materiales de tejido apropiados, su fijación con una solución de formaldehído (formalina), su deshidratación gradual con alcohol, su inclusión en parafina y el uso de un microtomo para cortar el tejido y fijarlo en un vidrio. Portaobjetos. Luego, las secciones de tejido se tiñeron con tinte de hematoxilina-eosina y finalmente se sellaron con pegamento de resina óptica. Las secciones de tejido preparadas se pueden almacenar durante mucho tiempo.
Los oculares y las lentes objetivas del microscopio se instalan en ambos extremos del cilindro de la lente y su distancia es fija. Coloque la sección de tejido en el escenario y gire el tornillo de ajuste aproximado para acercar el escenario a la lente objetivo. La sección de tejido ingresa al primer plano focal de la lente del objetivo y la imagen del tejido en la muestra se puede ver en el ocular. Luego utilice el tornillo de ajuste fino para que la imagen en el ocular sea clara y fácil de observar. Al cambiar el aumento, es necesario cambiar el ocular o el objetivo.
Los microscopios ópticos comúnmente utilizados en medicina y biología incluyen los 12 siguientes:
Un microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador de campo oscuro (Figura 4) bajo un microscopio óptico común. , y la luz emitida por la fuente de luz de abajo es reflejada por el condensador parabólico, formando un haz potente que atraviesa el campo de visión del microscopio sin entrar en la lente del objetivo. Por lo tanto, el campo de visión es oscuro y las partículas con un diámetro superior a 0,3 m en el campo de visión dispersan la luz y el tamaño y la forma se pueden ver claramente. Incluso se pueden ver partículas tan pequeñas como unos pocos nanómetros que no se pueden ver con un microscopio de campo claro normal. Por tanto, se suele utilizar para la biopsia de algunas bacterias, células, etc.
Un microscopio de estado sólido consta de oculares binoculares y lentes objetivos. La ampliación es de 7 a 80 veces. Ilumine por encima o por debajo de los lados con una luz de microscopio. En el ocular se forma una imagen real ampliada verticalmente, y se puede observar la forma tridimensional, el color y la microestructura de la superficie de objetos no procesados, se pueden realizar operaciones de microdisección y también se pueden observar secciones de tejido de organismos vivos.
Bajo la irradiación de ondas luminosas de longitud de onda corta (luz ultravioleta o luz azul violeta, longitud de onda 250 ~ 400 nm), algunas sustancias absorben energía luminosa, se excitan y liberan ondas luminosas más largas (azul, verde). con energía degradada, luz amarilla o roja, longitud de onda 400 ~ 800 nm), llamada fluorescencia. Una sustancia emite fluorescencia cuando se expone a radiación de onda corta. Por ejemplo, la mayoría de los lípidos y proteínas de los tejidos pueden emitir una fluorescencia azul clara después de la irradiación, lo que se denomina autofluorescencia. Sin embargo, la mayoría de las sustancias deben teñirse con tintes fluorescentes (como naranja de acridina, isotiocianato de fluoresceína, etc.) para emitir fluorescencia bajo irradiación de luz de onda corta. La fuente de luz de un microscopio de fluorescencia es una lámpara de mercurio de alta presión. La luz ultravioleta emitida por el microscopio de fluorescencia se filtra mediante un filtro de excitación (que puede excitar adecuadamente las sustancias fluorescentes en la muestra) y luego se emite al espejo dicroico de Proom para reflejar la luz de excitación hacia abajo y luego se proyecta a través de la lente objetivo hacia La muestra se tiñó con tintes fluorescentes. El tinte emite fluorescencia después de ser excitado, que se puede observar a través del objetivo, el espejo dicroico y el ocular. Se coloca un filtro de bloqueo debajo del ocular (que solo permite el paso de la fluorescencia de una longitud de onda específica) para proteger los ojos y reducir la oscuridad del campo de visión (Figura 4 [Principios ópticos del microscopio de fluorescencia]). La microscopía de fluorescencia se caracteriza por una alta sensibilidad. En campo oscuro, las tinciones fluorescentes de baja concentración pueden revelar la presencia de una muestra con un contraste aproximadamente 100 veces mayor que el de la microscopía de luz visible. En la década de 1930, la tinción fluorescente se utilizaba para observar y estudiar la morfología de bacterias, mohos y otros microorganismos, células y fibras. Por ejemplo, la tinción fluorescente acidorresistente puede ayudar a detectar Mycobacterium tuberculosis en el esputo. La tecnología de marcar proteínas con colorantes fluorescentes se desarrolló en la década de 1940. Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en técnicas convencionales de tinción de anticuerpos por inmunofluorescencia para detectar y localizar antígenos y anticuerpos en virus, bacterias, mohos, protozoos, parásitos, tejidos animales y humanos, y puede usarse para explorar causas y patogénesis, como clasificación y diagnóstico. de enfermedades glomerulares, relación entre papilomavirus y cáncer de cuello uterino, etc. Es ampliamente utilizado en investigación médica experimental y diagnóstico de enfermedades.
Cuando la luz emitida por la fuente de luz del microscopio polarizador atraviesa el aire y el vidrio ordinario, vibra en todas direcciones con la misma amplitud en un plano perpendicular a la luz, y rápidamente se propaga hacia el frente. . Este es el principio ondulatorio de la luz. El aire y el vidrio ordinario son cuerpos isotrópicos, también conocidos como refracción simple. Si la luz de la fuente de luz pasa a través de un cuerpo anisotrópico (también llamado cuerpo birrefringente), un haz de luz se dividirá en dos haces de luz con un solo plano de vibración y direcciones de vibración perpendiculares. La dirección de vibración, la velocidad, el índice de refracción y la longitud de onda de estos dos haces de luz son diferentes. De esta forma, la luz con un solo plano de vibración se denomina luz polarizada. Los microscopios polarizadores están diseñados para aprovechar este fenómeno.
En un microscopio polarizador, se inserta una lente analítica entre la lente objetivo y el ocular, y se incrusta una lente polarizadora entre la fuente de luz y el condensador, de modo que la platina circular pueda girar 360 grados (Figura 5 [Principio óptico de polarización Microscopio]). Cuando las lentes polarizadoras y analizadoras están en posiciones ortogonales, el campo de visión es completamente negro. Coloque el objeto a examinar en la platina del microscopio. Si el objeto tiene refracción única, el campo de visión permanecerá oscuro cuando se gire el escenario. Si después de girar la platina durante una revolución, el objeto en el campo de visión es brillante y oscuro, significa que el objeto es birrefringente. Muchas sustancias cristalinas (como cristales de urato en nódulos de gota, cálculos en el tracto urinario, cálculos biliares, etc.), fibras elásticas, fibras de colágeno, cromosomas y fibrillas de amiloide en tejidos humanos, etc. Es birrefringente y puede analizarse cualitativa y cuantitativamente mediante técnicas de microscopía de polarización.
El microscopio de fases también se llama microscopio de contraste de fases o microscopio de contraste de fases. La razón por la cual los microscopios ópticos comunes no pueden ver imágenes de tejidos, células, bacterias, virus y otros organismos vivos sin teñir es porque la diferencia (contraste) de la luz que pasa a través de la muestra es muy pequeña. Después de teñir la muestra, la amplitud (brillo) y la longitud de onda (color) cambian, afectando el contraste y la obtención de la imagen. Sin embargo, la tinción puede provocar la deformación de la muestra y la muerte biológica. Se debe utilizar microscopía de fase para observar tejidos, células u otros organismos vivos diminutos frescos y sin teñir. El principio de la microscopía de fase es que dos ondas de luz interfieren entre sí debido a la diferencia de fase, y la intensidad y el contraste de las ondas de luz cambian, formando una imagen visible. La luz procedente de una fuente puntual puede aparecer como un patrón sinusoidal (Figura 6a [Microscopía de fase]). La distancia entre los dos picos es la longitud de onda y la amplitud de la onda representa el brillo de la luz (gran amplitud, alto brillo). Imagine dos ondas de luz de la misma fuente de luz viajando simultáneamente a través del aire y un medio transparente. Al pasar a través de un medio transparente de cierto espesor, la velocidad de la onda de luz disminuirá, pero el brillo de la luz no cambiará. Después de que la onda de luz pasa a través del medio transparente, queda rezagada con respecto a otra onda de luz que ha estado avanzando por el aire, por lo que se produce el cambio de fase (diferencia de fase) de las dos ondas de luz. Pero el ojo humano no puede distinguir la diferencia de fase entre estos dos rayos paralelos. Si estas dos ondas de luz inciden en el mismo punto de la pantalla, una onda de luz se retrasa media longitud de onda con respecto a la otra, es decir, las dos ondas de luz interfieren entre sí y se anulan debido a fases opuestas, y la luz desaparece. o las amplitudes relativas interactúan entre sí y la luz se debilita. Si una onda de luz se retrasa una longitud de onda, pero dos ondas de luz están en fase, la luz se ve realzada por la superposición de las ondas.
La estructura básica de un microscopio de fases es la misma que la de un microscopio óptico común. Las diferencias son las siguientes: ① En la lente del objetivo, se instala una placa de fase en forma de disco en el segundo plano focal de la lente del objetivo (Figura 6b [Microscopio de fase]). (2) Debajo del condensador, instale un haz anular en el primer plano focal del condensador y talle una hendidura estrecha en el haz para permitir que pase la luz anular fuerte (Figura 6c [Microscopio de fase]). Como se muestra en la Figura 6d, la luz emitida desde el punto A del haz anular se convierte en luz paralela después de pasar a través del condensador. Cuando la luz pasa a través de la muestra en el escenario, se producirán interferencias y difracción debido al diferente índice de refracción de cada partícula en la muestra (como el punto B), que se divide en ondas no polarizadas (líneas continuas) y ondas polarizadas (líneas discontinuas). ). La onda no polarizada es enfocada por la lente del objetivo y representada en el punto A de la placa de fase, luego pasa a través de la placa de fase y se distribuye uniformemente en la superficie de la imagen de la muestra para convertirse en el fondo. Después de que la onda desviada pasa a través de la lente del objetivo, pasa por alto el punto A de la placa de fase, pasa a través de la placa de fase y también se enfoca en el punto b en el plano de la imagen. En otras palabras, la onda insesgada y la onda desviada pasan por diferentes partes de la placa de fase. La aplicación de diferentes recubrimientos en diferentes áreas de la placa de fase puede cambiar la velocidad y el brillo de la onda insesgada o de la onda sesgada respectivamente, de modo que las dos ondas de luz tengan una diferencia de fase de media longitud de onda o una longitud de onda, y sus posiciones en la imagen. plano La onda combinada tendrá un contraste claro y oscuro, y se podrán ver todos los detalles de la muestra.
En resumen, la microscopía de fase utiliza la diferencia en el índice de refracción de las partículas en la muestra o la diferencia en el espesor de las partículas para producir una diferencia de fase en la luz, de modo que las muestras frescas se puedan ver sin mancharse y las partículas En las células vivas se pueden observar microestructuras como las mitocondrias y los cromosomas. También se puede utilizar para estudiar organismos vivos más pequeños, como mohos, bacterias, virus, etc., para observar comportamientos biológicos como la forma, cantidad, actividad, división y reproducción de las muestras, y para medir y comparar.
La lente objetivo de un microscopio invertido se dirige hacia abajo, hacia la muestra. El objetivo de un microscopio invertido está en posición vertical, de modo que el eje longitudinal del ocular y el tubo forman un ángulo de 45 grados con respecto al eje longitudinal del objetivo. El área del escenario es grande. Sobre la lente del objetivo hay un condensador de distancia focal larga y una fuente de iluminación. Los objetivos y condensadores pueden equiparse con accesorios para microscopía de fase. La ampliación es de 16 a 80 veces. Los frascos de cultivo de tejidos y los platos de cultivo se pueden colocar directamente sobre la mesa para observar la morfología, cantidad y dinámica de muestras frescas, organismos vivos y células sin teñir.
Los resultados se pueden ver en placas de microbiología e inmunorreacción de múltiples pocillos. El microscopio invertido se puede reemplazar por una lente óptica de campo claro ordinaria; se pueden ensamblar accesorios de diferencia de interferencia diferencial y fluorescencia para la observación.
El microscopio de interferencia diferencial (DIC) también se llama microscopio de interferencia o interferencia. Puede ver y medir pequeños cambios de fase, similar a un microscopio de fase, lo que permite que las muestras incoloras y transparentes tengan cambios de luz y oscuridad y de color, mejorando así el contraste. En la estructura básica de un microscopio óptico ordinario se instalan elementos de polarización e interferencia y una platina giratoria de 360 grados para utilizar el principio de interferencia de la luz polarizada. Como se muestra en la Figura 7 [Principio óptico de la microscopía diferencial de interferencia diferencial], encima de la fuente de luz se colocan un polarizador y un prisma de división del haz. La luz linealmente polarizada del polarizador pasa a través del prisma divisor del haz y se divide en dos haces de luz linealmente polarizada que vibran perpendicularmente entre sí. Estos dos rayos son refractados por el condensador y dirigidos hacia la muestra. Debido a que cada partícula de la muestra tiene un índice de refracción diferente, la fase de algunas ondas de luz cambia y se desplaza lateralmente por la interferencia. Después de que los dos haces de luz pasan a través de la lente del objetivo, son combinados por el segundo conjunto de prismas divisores de haz y son interferidos por el analizador. Cada punto de la imagen final es una imagen híbrida formada por la superposición de dos imágenes diferentes del mismo punto en el objeto, de modo que pueda ser reconocido a simple vista.
La microscopía de interferencia diferencial también puede observar objetos incoloros y transparentes que no se pueden ver en un campo brillante ordinario. Puede observar células, bacterias y otros objetos vivos. Las imágenes son tridimensionales y más detalladas y realistas que las de fase. microscopios. Puede utilizarse para realizar estudios más detallados de diversas partes de las células vivas. Si se ilumina con luz blanca, aparecerán varios colores en diferentes fases. A medida que el escenario gira, los colores cambian. La luz monocromática produce contraste entre la luz y la oscuridad, y varios componentes presentan diferentes contrastes. La microscopía de interferencia diferencial también se puede utilizar como balanza ultramicroóptica de alta precisión. La masa exacta de un objeto seco se puede estimar en tan solo 1 × g por cada aumento del 1% en la concentración de materia sólida en una celda. su índice de refracción aumenta en 0,0018. El índice de refracción de cada fase de la célula se puede estimar en función de la diferencia de especies con el área asociada (área suspendida), lo que permite un cálculo adicional del peso seco de ciertos componentes de la célula.
Microscopio fotográfico Los microscopios modernos de alta calidad pueden equiparse con diversos accesorios para microfotografía y pueden guardar datos científicos de manera oportuna y completa. Los microscopios para fotografía requieren estructuras precisas de sistemas y piezas ópticas, así como cuerpos de espejo fuertes y estables. Equipado con tres tubos oculares, incluidos dos tubos oculares de observación de 45 grados y un tubo vertical central equipado con una cámara 135, accesorios de medición de exposición, oculares fotográficos y lentes de visor, que se pueden utilizar para encuadrar y enfocar. El condensador puede ajustar el centro del campo de visión y está equipado con un diafragma de apertura para iluminar uniformemente el campo de visión. La base de la lente está equipada con un diafragma de campo ajustable, un voltímetro y una luz indicadora de voltaje. Hay una resistencia variable para ajustar el brillo de la iluminación. La fuente de iluminación es una bombilla halógena de 6 ~ 12 V 40 ~ 100 W. En la década de 1980, los equipos de microfotografía de exposición automática tenían varias funciones, como el enrollado automático de la película, la medición automática, el control automático de la exposición, la medición y el ajuste de la temperatura del color y la compensación de fallos de la ley de reciprocidad. Todo esto es controlado automáticamente por una computadora, que puede proyectar películas fotosensibles en blanco y negro, películas negativas en color y diapositivas en color.
El tubo de lente vertical central también puede equiparse con una cámara de televisión o una cámara de cine de 16 mm y un dispositivo de control, que puede congelar o grabar continuamente especímenes vivos a intervalos regulares.
El sistema de fotomicroscopio universal para investigación integra funciones como campo brillante ordinario, campo oscuro, luz polarizada, fluorescencia, fase, diferencia de interferencia diferencial y fotomicrografía. También hay funciones como el enfoque automático controlado por computadora, el cambio automático de lentes de objetivo, la adaptación automática de condensadores y el ajuste automático del brillo de la fuente de luz. El cuerpo está equipado con dos cámaras de 135 mm y una cámara de gran formato de 4×5 pulgadas. También puede instalar cámaras de televisión y cámaras de película de 16 mm, y tiene muchas funciones como bobinado automático de película, medición automática, control automático de exposición, medición y ajuste de la temperatura del color y compensación de fallas del cuerpo con cuenta regresiva.
El poder de resolución de un microscopio electrónico está limitado por la longitud de onda de la luz utilizada. Los objetos más pequeños que la longitud de onda de la luz no se pueden visualizar debido a la difracción. La resolución de los microscopios ópticos más modernos está limitada a aproximadamente 200 nanómetros (2000 nanómetros). Para superar este límite, se pueden utilizar rayos de electrones en lugar de ondas de luz. Cuando las partículas de electrones se mueven a altas velocidades, su comportamiento es similar al proceso de propagación de las ondas de luz. La longitud de onda de un electrón en movimiento depende de su velocidad. Cuando el voltaje aumenta a 500.000 voltios, su longitud de onda es de 0,001 nm (0,01), es decir, la longitud de onda de los rayos de electrones es aproximadamente una cienmilésima parte de la luz visible, la resolución es de aproximadamente 4 y el aumento es muchas veces mayor que el microscopio óptico más avanzado. Los microscopios que utilizan rayos de electrones como fuente de luz se denominan microscopios electrónicos.
La resolución de los microscopios electrónicos utilizados en la medicina y la biología modernas es de 5 a 10, es decir, el aumento es de 10 a 200.000 veces.
Debido a los diferentes espesores de las muestras, las muestras finas cortadas mediante ultramicrótomo se pueden observar con un microscopio electrónico de transmisión. Las muestras que no se pueden cortar muy finas se pueden observar con un microscopio electrónico de barrido.
La microscopía electrónica de transmisión es el microscopio electrónico más utilizado. El cañón de electrones consta de un cañón de electrones, un sistema de lentes electromagnéticos, una pantalla fluorescente (o cámara), un cilindro de lente, un soporte de lente, un transformador, un regulador de voltaje, un cable de alto voltaje, un sistema de bomba de vacío, una consola. y otros componentes Es equivalente a la fuente de luz de un microscopio óptico, que suministra y acelera el cátodo. Un haz de electrones emitido por un filamento de tungsteno caliente. El voltaje utilizado por los microscopios electrónicos es generalmente de 200.000 a 300.000 voltios, lo que es suficiente para hacer que los electrones del cañón de electrones salgan volando a gran velocidad. Los electrones pasan a través de la lente del condensador y llegan a la muestra. Debido a que la muestra es muy delgada, los electrones de alta velocidad pueden pasar a través de ella, y debido a que el espesor o la densidad de cada parte de la muestra es diferente, los electrones que la atraviesan también son diferentes. El voltaje debe ser estrictamente estable para lograr imágenes estables y pequeños cambios de voltaje pueden causar interferencias graves. El brillo de la imagen se puede controlar mediante un cañón de electrones.
El grupo de lentes electromagnéticas es equivalente a la lente condensadora, la lente objetivo y el sistema ocular en la lente óptica. A medida que el haz de electrones pasa a través del centro del campo magnético circular de cada lente electromagnética, se puede enfocar para producir una imagen. El sistema de lentes de un microscopio electrónico consta de cuatro grupos de lentes electromagnéticas, que incluyen una lente condensadora, una lente objetivo, una lente intermedia y una lente de proyección (ocular). La corriente en el condensador se puede cambiar para enfocar el haz de electrones en la muestra, proporcionando "iluminación". La lente del objetivo está cerca del foco de la muestra. Mediante el aumento de tres etapas de la lente objetivo, el espejo intermedio y la lente de proyección, se puede obtener una imagen de gran aumento a una cierta distancia y la imagen final se proyecta en la pantalla. Se puede utilizar una película en blanco y negro para crear una base fotográfica sobre una pantalla fluorescente. Cambiar la corriente en la bobina electromagnética hace que la lente electromagnética se enfoque, produciendo diferentes aumentos (Figura 8 [Microscopio electrónico de transmisión]).
Para minimizar la posibilidad de dispersión cuando los electrones chocan con las moléculas de aire en un microscopio electrónico, el vacío dentro del tubo de la lente es muy alto, por lo que el tubo de la lente sellado se conecta a una bomba de vacío. Debido a que la muestra debe colocarse en un tubo de vacío, no se pueden examinar materiales vivos.
Los espejos ópticos utilizan principalmente ondas de luz visible como fuente de luz. Una vez teñida la muestra, la longitud de onda (color) y la amplitud (brillo) de la luz cambian, afectando el contraste y la obtención de la imagen. Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones. El poder de penetración del haz de electrones no es fuerte y las muestras para microscopía eléctrica deben cortarse en rodajas de entre 50 y 100 nm. Los pasos para realizar secciones de microscopía electrónica son similares a los de la microscopía óptica y también constan de procedimientos como fijación, deshidratación, inclusión, corte y tinción. Primero se retira material de la muestra a observar, con un volumen aproximado de 1. Después de una doble fijación con glutaraldehído y tetróxido de osmio, se deshidrataron paso a paso con alcohol (o acetona), se embebieron en resina epoxi y se seccionaron con un ultramicrótomo. En microscopía electrónica, la imagen se forma como resultado de la dispersión de electrones de diferentes partes de la lámina de tejido, siendo las partes densas (detalles) de la muestra una gran dispersión. Se pueden usar varias sales de metales pesados para aumentar el contraste. El acetato de uranilo y el citrato de plomo se usan comúnmente para el teñido doble. Debido a que los haces de electrones no pueden atravesar el vidrio, las secciones de película teñidas se colocan sobre una pequeña rejilla de cobre para microscopía electrónica.
La tecnología de grabado por congelación es una nueva tecnología de procesamiento de muestras mediante microscopio electrónico inventada en la década de 1950 y mejorada continuamente posteriormente. El principio fundamental es triturar muestras biológicas que se congelan rápidamente en nitrógeno líquido a temperatura ultrabaja (-200 °C) en un dispositivo de congelación al vacío, exponiendo las estructuras internas de los orgánulos en diferentes partes, mostrando estructuras tridimensionales de diferentes alturas. Rocíe una capa de película de carbono platino (réplica) sobre la superficie de fractura recién formada. Las muestras recubiertas se digieren en una solución corrosiva ácida fuerte o alcalina, el recubrimiento se hace flotar, se recupera y se limpia, y se coloca sobre una pequeña rejilla de cobre para observación y fotografía con microscopio electrónico. La tecnología de grabado por congelación juega un papel importante en el estudio de las estructuras de biopelículas celulares (como membranas celulares, mitocondrias, retículo endoplásmico, etc.). ).
La microscopía electrónica de barrido (SEM) se utiliza para generar imágenes ópticas electrónicas en la superficie gruesa de la muestra (Figura 9 [imagen de estructura SEM]). Los principios estructurales del cañón de electrones y la lente electromagnética del microscopio electrónico de barrido son similares a los del microscopio electrónico de transmisión. Una gran cantidad de electrones generados por el cañón de electrones convergen continuamente mediante tres conjuntos de lentes electromagnéticas para formar rayos de electrones muy delgados (sondas de electrones). Bajo la acción de dos pares de bobinas de desviación en el tubo del microscopio electrónico, este haz de electrones explora a su vez la superficie de la muestra. Dado que la corriente del generador de ondas en dientes de sierra alimenta al mismo tiempo dos juegos de bobinas de desviación en el cilindro de la lente del microscopio electrónico y en el tubo de visualización, los rayos electrónicos de la pantalla producen una exploración sincrónica en la pantalla fluorescente.
Los electrones emitidos por la muestra son recogidos por el detector, amplificados por el amplificador de vídeo y controlado el brillo del tubo de visualización. Por lo tanto, el brillo del escaneo en la pantalla fluorescente está controlado por la cantidad de electrones generados en los puntos correspondientes de la superficie de la muestra, mostrando así una imagen de gran aumento de la muestra en la pantalla fluorescente. Controlando la corriente de los dos conjuntos de bobinas de desviación, se puede controlar el factor de amplificación. Además, se instaló el mismo tubo de visualización de escaneo sincronizado para fotografía.
En la preparación de muestras de microscopio electrónico de barrido, es necesario deshidratar y básicamente mantener su estado natural, por lo que se adopta una tecnología crítica de liofilización de las muestras: limpieza de la superficie del tejido, fijación con glutaraldehído y tetróxido de osmio, acetona. Deshidratación paso a paso. Debido a que el acetato de amilo es muy fácil de reemplazar con Co licuado, primero se usó un gradiente de acetato de amilo para reemplazar la acetona. Luego se colocó la muestra en una cámara de presión cerrada y se introdujo Co líquido para sumergir la muestra. El monóxido de carbono reemplaza rápidamente por completo al acetato de amilo en la muestra y lo expulsa de la cámara de presión. Al mismo tiempo, la conversión mutua entre el Co líquido y las moléculas de Co gaseoso que se evaporan rápidamente en la cámara de presión alcanza un equilibrio dinámico. Cuando la temperatura aumenta gradualmente, la evaporación del Co líquido se acelera y la densidad disminuye en consecuencia. Cuando la temperatura crítica del Co alcanza los 31,1°C, la densidad de las fases gaseosa y líquida es la misma, y la diferencia entre las dos fases desaparece por completo, es decir, se alcanza el equilibrio de fases y la tensión superficial es cero en este momento. . Mantenga la temperatura ligeramente por encima de la temperatura crítica y ventile lentamente el gas de monóxido de carbono. Cuando se agota el monóxido de carbono, la muestra se seca. Saque la muestra seca y rocíela al vacío con una capa de aleación de carbono, o colóquela en una máquina de recubrimiento iónico para platino u oro para aumentar la conductividad de la muestra, mejorar el contraste y mejorar la estabilidad de la muestra. Luego se puede observar con un microscopio electrónico de barrido.
El microscopio electrónico de barrido (SEM) tiene las ventajas de alta resolución, gran profundidad de campo, amplio campo de visión, visualización de estructura tridimensional, fácil observación y preparación sencilla de muestras. Se utiliza cada vez más en biología y medicina para observar y estudiar la forma de expresión y la estructura tridimensional interna de especímenes biológicos. La resolución del microscopio electrónico de barrido ha alcanzado 70 y se puede observar directamente la estructura molecular del ácido desoxirribonucleico (ADN).