Control de contraste en fotomicrografía
El impacto de la propia muestra en el contraste
El grosor de los cortes de la muestra provoca la refracción y el reflejo de la luz, mientras que las estructuras detalladas se superponen.
Los ejemplares son frescos, coloridos y contrastantes.
El grosor, el color y las líneas de agua de los portaobjetos o las cubiertas de muestras pueden reducir el contraste.
El impacto de la iluminación en el contraste: La iluminación debe ser moderada, de lo contrario el contraste se reducirá. Demasiado brillante afectará la estructura detallada de la muestra y demasiado oscuro hará que aparezca suciedad en el camino de la luz en la pantalla.
Cuando el diámetro del haz es el mismo que el campo de visión, el contraste es fuerte. Cuando el diámetro del haz es mayor que el campo de visión, el contraste disminuirá.
El impacto del colector y la apertura en el contraste: si el colector es demasiado bajo, la apertura y el diafragma son pequeños, el contraste se reducirá y será necesario levantar el colector o abrir la apertura según la situación específica. El diámetro del diafragma del iris debe coincidir con la apertura del objetivo.
El efecto de los filtros de color sobre el contraste: los filtros de color complementarios tienen un fuerte contraste y los filtros de color uniformes tienen un contraste débil.
Aunque el contraste de la microscopía óptica es mejor, hay que manejarlo adecuadamente, de lo contrario se perderá la estructura detallada, la resolución se verá afectada y no se conseguirán resultados perfectos.
Adjunto: Estructura, obtención de imágenes y rendimiento de los microscopios ópticos
Según los diferentes usos, existen muchos tipos de microscopios ópticos modernos, como microscopios biológicos, microscopios metalográficos, microscopios de disección, etc. . , pero la estructura básica sigue siendo óptica y mecánica.
Los microscopios ópticos individuales (lupas, espejos de disección, etc. de uso común) no son adecuados para la microfotografía debido a su estructura óptica simple, su pequeño aumento y sus aberraciones obvias, por lo que no los presentaremos aquí.
El microscopio compuesto tiene un sistema óptico relativamente completo y un dispositivo mecánico relativamente complejo, que es adecuado para trabajos microscópicos;
1. trayectoria de la luz del microscopio;
Forma una trayectoria de luz amplificadora a través de dispositivos ópticos como oculares y lentes objetivos, de modo que la distancia entre las imágenes virtuales A y B es exactamente igual a la distancia visual del ser humano. ojo -250 mm, obteniendo así una imagen visible de la muestra ampliada de 10 a 200 veces.
2. Estructura básica del microscopio óptico
La estructura básica del microscopio óptico se divide en dos partes. Una parte es el sistema óptico, como oculares, lentes objetivos, condensadores, fuentes de luz, etc. , la otra parte es el sistema mecánico, como patillas, brazos de espejo, cilindros de lentes, platina, convertidor de lentes objetivos, tornillos grandes y pequeños, hélices, etc.
(1) Lente objetivo
La lente objetivo es un componente clave de un microscopio óptico. La lente objetivo determina la calidad de la imagen y la resolución de todo el sistema del microscopio. Consiste en un conjunto de lentes de precisión que magnifican ejemplares por primera vez. Se han realizado varias correcciones de aberraciones en la producción de objetivos microscópicos. Tiene una apertura (un diafragma de apertura) que controla el diámetro del haz de luz incidente y se utiliza para estrechar o ampliar el campo de visión sin cambiar el brillo de la imagen.
Las lentes objetivas tienen diferentes aumentos, y en circunstancias normales se utilizan sistemas secos para la observación. En un sistema de inmersión en agua o en un sistema de inmersión en aceite, se debe agregar agua o aceite a la costura entre la lente del objetivo y la muestra durante la observación.
Debido a que la calidad de imagen del objetivo afecta los efectos de la fotografía y la observación, el objetivo también es una parte importante de la microfotografía.
Una lente de objetivo tiene tres parámetros principales: apertura numérica, aumento y grosor de la cubierta. Están marcados en la carcasa de la lente.
① n a value
La apertura numérica N A es un parámetro importante que caracteriza el rendimiento de trabajo de la lente del objetivo, que determina la resolución de la lente del objetivo. N a = n sen θ donde n es el índice de refracción del medio y q es el ángulo de incidencia.
Se da la relación entre la apertura numérica de la lente del objetivo, el índice de refracción del medio y el ángulo de incidencia. El ángulo de incidencia máximo teórico es 180, el seno de la mitad (90) es igual a 1, y el índice de refracción del aire es 1,0, el del agua es 1,33 y el de la trementina es 1,5. Por lo tanto, en el mismo ángulo de incidencia, el valor numérico de la lente del objetivo de inmersión en líquido es mayor que el valor numérico de la relación de apertura de la lente del objetivo seco.
Cuanto mayor sea el valor de NA, mayor será la resolución, cuanto menor sea el valor de NA, mayor será la profundidad de campo y la profundidad de enfoque.
El valor de N A todavía está relacionado con el ángulo del espejo.
Cuanto mayor sea el ángulo del espejo, mayor será la cantidad de luz que entra, más clara será la imagen en el campo de visión y mayor será la resolución. Por otro lado, la resolución es demasiado pequeña para verla con claridad. Debido a que el ángulo de espejo de un objetivo de bajo aumento es menor que el de un objetivo de alto aumento, la resolución de un objetivo de bajo aumento no es tan alta como la de un objetivo de alto aumento. (Esto significa que para los sistemas secos, los objetivos de inmersión en aceite tienen un índice de refracción dieléctrico, que puede mejorar la resolución.
La resolución también se ve afectada por la intensidad de la iluminación y la longitud de onda de la fuente de luz. Dentro de un cierto rango, mayor es la iluminación. intensidad Cuanto mayor sea la resolución, mayor será la ampliación.
②Ampliación
La ampliación se refiere a la ampliación de la inspección (es decir, la ampliación de la imagen virtual). aumento, cuanto más cercana es la distancia de trabajo Para cada objetivo específico, su aumento y distancia de trabajo son constantes. Si usa un ocular de 10 × y un objetivo de 40 ×, el aumento al observar es de 400 veces, pero para la fotomicrografía, debido a la distancia. desde el ocular hasta la placa fotosensible es necesario ampliarlo, por lo que no es 400 veces. El aumento de algunas fotomicrografías es 0/2 del aumento del microscopio 65438.
③Requisitos de espesor del protector. capa
El espesor de la cubierta requerida por el microscopio es 1/100 del espesor del tubo de la lente, alcanzando 0,16 ~ 0,17 mm. Por cada 0,01 mm de diferencia, el tubo de la lente debe reemplazarse por 10 mm. de lo contrario, el aumento no será el aumento marcado.
Las lentes de inmersión en aceite utilizan aceite. El índice de refracción mejora el brillo y la resolución del campo de visión. Después del engrase, la lente objetivo y la muestra forman un grupo óptico.
Los aceites puntuales e índices de refracción más utilizados de los espejos de inmersión en aceite son:
Aceite de abeto 1,51
Aceite de sándalo 1,51
Glicerina. 1,46
Chicle 1,52
Styrax 1,58
Índice de refracción Cuanto más grande sea la imagen, más fuerte será el brillo de la imagen y mayor será la resolución
<. p>(2) OcularEl ocular tiene principalmente las dos funciones siguientes: una es realizar la primera imagen ampliada emitida por la lente del objetivo
La segunda es. para corregir la diferencia de fase, la aberración cromática y la iluminación en la imagen de la lente del objetivo, el aumento del ocular generalmente está entre × 4 y × 25. El aumento del tubo de la lente es grande; de lo contrario, el aumento es pequeño.
El punto del ojo es un parámetro importante del ocular, que es particularmente importante en microfotografía. El punto del ojo es el punto de salida formado en el ocular después de enfocar el microscopio. Generalmente, cuanto mayor es el aumento, mayor es la distancia entre ellos. el punto del ojo y el ocular. Cuanto más corta sea la distancia, menor será el aumento y mayor será la distancia. Al observar visualmente, la pupila solo toca este punto. Cuando se dispara con una cámara con lente, la superficie de la lente debe. esté en contacto con este punto Al disparar con una cámara, calcule el tamaño extendido del dispositivo de primer plano (fuelle retráctil o anillo de primer plano) desde el punto del ojo para calcular el aumento real
(. 3) Condensador
Los condensadores de microscopio incluyen condensadores de campo claro, condensadores de campo oscuro y condensadores para fines especiales (como luz polarizada, diferencia de fase, etc.).
①Condensador de campo brillante
El condensador de campo claro está compuesto por colectores de luz. Consta de cuatro partes: un filtro, un arco iris, un anillo de filtro de color y un reflector.
El condensador está compuesto por dos o más lentes, como una simple. Lente de cámara, con una apertura numérica (NA) de aproximadamente 1,20 ~ 1,40. Su función principal es mejorar el brillo del campo de imagen y la resolución de la lente del objetivo en la muestra.
②Color del arco iris
La estructura es como la apertura de una cámara, que no solo puede ajustar la intensidad de la luz, sino también cambiar la resolución y el contraste, es decir, el arco iris es grande. , la resolución es alta y el contraste es débil. El anillo de filtro de color se utiliza para colocar filtros de color o vidrio esmerilado, que se pueden utilizar para cambiar el color o el brillo de la luz.
Las placas reflectantes se dividen en bordes planos y bordes cóncavos, y el haz de luz debe apuntar al centro del reflector.
③El fondo del condensador de campo oscuro es oscuro y el sujeto brilla o se ilumina.
Los condensadores de campo oscuro se utilizan a menudo para fotografiar objetos diminutos como gelatina química, Treponema pallidum o muestras sin teñir que no se pueden ver en campo claro. También se utiliza habitualmente en microscopía de fluorescencia. Al disparar con un condensador de campo oscuro, la fuente de luz es mucho más brillante y no se pueden utilizar filtros de color. Para evitar interferencias de la luz exterior, la fotomicrografía de campo oscuro se realiza mejor en un cuarto oscuro.
3. El rendimiento principal del microscopio óptico
El rendimiento principal del microscopio óptico se refleja en dos aspectos, a saber, el aumento y la resolución.
(1) Aumento
Teóricamente, el aumento de un microscopio óptico es el aumento de la lente objetivo × el ocular cuando la longitud del cilindro de la lente es de 16 ~ 17 cm, pero necesitamos ver el objeto real claramente, no sólo para ampliar, sino también para distinguir su forma detallada, por lo que el factor de aumento debe considerarse al mismo tiempo que la lente del objetivo y la resolución. Por ejemplo, el ocular y el objetivo de un microscopio con el mismo aumento de 200 veces se pueden combinar de tres maneras: 4 0 × 5, 20 × 10 y 10 × 20. Sin embargo, la resolución y la profundidad focal de las tres combinaciones Depende del brillo de la superficie de la imagen y del tiempo de disparo. La velocidad de obturación utilizada marca una gran diferencia.
Lente objetivo (1) 20×10 (2) 41×5 (3) 10×20.
La resolución de la apertura numérica de la lente del objetivo, la profundidad focal y el brillo del plano focal son superiores a la velocidad de obturación de la fotografía 0,40±0,70? 0,43? 0,77? 0,8 1/200 segundos 0,25 1,1 ? 2,0?0,4 1/40
En fotomicrografía, el aumento está relacionado con la distancia desde el punto de salida hasta la placa fotosensible, por lo que la fórmula para calcular el El aumento de la fotomicrografía es M = aumento de la lente del objetivo × relación de aumento del ocular × distancia desde el punto de salida del ocular a la película/250 mm. Esta fórmula muestra que solo cuando la distancia desde el punto de salida del ocular a la placa fotosensible es de 250 mm, el aumento. de la fotomicrografía es igual al aumento del objetivo × aumento del ocular. Si aumenta la distancia desde el punto de salida del objetivo a la placa fotosensible, también aumentará la ampliación, pero esto es sólo un aumento morfológico y la resolución permanece sin cambios. Cuando utilizas un negativo para ampliar una foto, solo amplía la forma y no aumenta la resolución.