¿Cuál es la aplicación de la biología y la tecnología agrícola modernas en la investigación y producción de plantas medicinales?
En 1902, G. Haberlandt, quien fue el primero en realizar experimentos de cultivo de tejidos vegetales, predijo que las células aisladas de plantas superiores podrían convertirse en plantas. Esta hipótesis se convirtió en la base teórica para el cultivo de tejidos vegetales en el futuro.
En 1937, White estableció un medio integral para el cultivo de tejidos y, junto con Gautheret et al., utilizó por primera vez con éxito células madre de cambium de tabaco y pequeños trozos de raíces de zanahoria para proliferar e inducir en cultivo artificial. condiciones. Los métodos básicos de cultivo de tejidos vegetales que establecieron se convirtieron en la base técnica para diversos cultivos de tejidos vegetales en el futuro.
En 1948, F. Skoog y Cui Pei descubrieron que añadiendo una proporción adecuada de adenina y auxina al medio de cultivo para el cultivo de tallos y médula de tabaco se puede controlar el crecimiento de plántulas o raíces a partir de tejidos vegetales, y también Es decir, cuando la proporción de adenina a auxina es alta, se producen brotes y cuando la proporción es baja, se forman raíces. Más tarde, C.D. Miller et al. (1956) descubrieron que el uso de cinetina en lugar de adenina era más eficaz y establecieron un modelo hormonal en el que la proporción entre cinetina y hormona del crecimiento controla la diferenciación de órganos. Esta teoría de la "cibernética" hormonal todavía desempeña un papel rector en la investigación sobre cultivos de tejidos vegetales.
En la década de 1950, la tecnología de cultivo de tejidos se desarrolló rápidamente, desde el cultivo sólido estático hasta el cultivo líquido, incluyendo el cultivo en suspensión, el cultivo en microcámaras, el cultivo en vivero y el cultivo en placas. En 1958, Steward et al. utilizaron cultivos en suspensión líquida para desarrollar células somáticas de zanahoria en plantas completas a través del desarrollo del cuerpo embrioide, y luego florecieron y produjeron frutos. Este avance no sólo confirmó la idea de Haberlandt sobre la "totipotencia celular", sino que también abrió un nuevo campo para el estudio de la formación de órganos y la embriogénesis en cultivo de tejidos.
A principios de la década de 1960, E.C. Cocking y otros aislaron con éxito protoplastos de plantas utilizando celulasa fúngica, creando las condiciones para el rápido desarrollo de la ingeniería genética, como la tecnología de fusión de protoplastos y la hibridación de células somáticas.
En las últimas dos décadas, debido a la totipotencia de las células vegetales cultivadas bajo ciertas condiciones, la aplicación de la tecnología de cultivo de tejidos en la producción ha sido valorada y desarrollada, y gradualmente se ha convertido en una herramienta clave en la agricultura, la silvicultura , horticultura, medicina, etc. Es un método de investigación importante en diversos aspectos y promueve el progreso de una serie de disciplinas como la morfología, citología, fisiología, bioquímica, genética y mejoramiento genético.
Con el desarrollo de la biología molecular y la bioingeniería, la tecnología del cultivo de tejidos vegetales es cada vez más perfecta. Después de la década de 1960, el cultivo de tejidos vegetales comenzó a utilizarse en la producción, lo que llevó la producción vegetal a un período de aplicación industrial. Las flores y hierbas, la rápida propagación de plantas mediante líneas de propagación vegetativa, la comercialización de variedades de probeta producidas en fábricas y la producción de medicamentos mediante tecnología de cultivo celular en masa han tenido éxito en el Japón, la República Federal de Alemania y otros países. En resumen, el cultivo de células y tejidos vegetales es una nueva biotecnología con un gran potencial que entrará en las filas de la nueva revolución industrial mundial con una nueva apariencia y con perspectivas brillantes.
En la actualidad, la aplicación práctica de la tecnología de cultivo celular y de tejidos vegetales en botánica y otras disciplinas se centra principalmente en dos aspectos: (1) mejoramiento vegetal y propagación rápida; (2) producción de sustancias fisiológicamente activas.
1. Equipo experimental, métodos de esterilización y medio básico para el cultivo de tejidos vegetales
(1) Equipo experimental para el cultivo de tejidos vegetales
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(1) El quirófano estéril está equipado con un banco de trabajo purificado para la inoculación, un banco de trabajo para colocar herramientas y cultivos de inoculación y lámparas ultravioleta instaladas en el techo o la pared para la esterilización. Lo mejor es tener ventilación para filtrar las bacterias.
(2) Sala de preparación de medios de cultivo
Para preparar diversos medios de cultivo, la sala debe contar con una gran mesa de trabajo plana y gabinetes para colocar diversos productos químicos y utensilios. Refrigerador para almacenar solución madre de medio de cultivo preparado, equipo para preparar y almacenar agua destilada.
(3) Sala de cultivo a temperatura constante
La sala de cultivo requiere aire acondicionado para controlar la temperatura constante y dispositivos de iluminación. Generalmente, la temperatura de la incubadora se mantiene alrededor de 25°C y la diferencia de temperatura no debe exceder los 65438±0°C.
La sala de cultivo debe contar con bastidores de cultivo, agitadores, mesas giratorias y otros dispositivos y equipos de cultivo.
(4) Laboratorio de citología
Se colocan diversos microscopios y espejos de disección para observar los resultados del cultivo. Si las condiciones lo permiten, se pueden instalar equipos de fotografía para capturar los resultados experimentales.
(5) Laboratorio de química
Preparar diversos instrumentos y equipos de análisis y medición químicos convencionales y avanzados para realizar diversos análisis y mediciones químicos.
2. Instrumentos y utensilios
(1) Cristalería
Instrumentos y utensilios fabricados con vidrio duro y de baja solubilidad en álcalis, especialmente para cultivos a largo plazo, Si Si elige productos de vidrio que no sean de alta calidad, es fácil que se produzcan efectos adversos.
El material de vidrio de uso común incluye: matraz Erlenmeyer, matraz de tetina, tubo en T, matraz angular, matraz redondo, tubo de ensayo en forma de L, tubo de ensayo angular paralelo, matraz plano redondo, placa de Petri, anillo de vidrio, portaobjetos. , cubreobjetos, embudos, dispensadores, jeringas, matraces de fondo redondo, embudos de decantación, placas de vidrio, columnas de vidrio, condensadores, extractores, tinciones.
(2) Utensilios e instrumentos
Seleccionar dispositivos e instrumentos médicos utilizados en los laboratorios de microbiología, como cuchillos, tijeras, pinzas, bisturíes, agujas de inoculación, etc.
(3) Instrumentos y equipos
Generalmente requieren balanzas, acidímetros, centrífugas, microscopios, espejos de disección, incubadoras, hornos, refrigeradores, agitadores, lechos giratorios y bastidores de cultivo giratorios, espectrofotómetro. , escáner de capa fina, cromatógrafo líquido de alta presión, etc.
(2) Métodos de esterilización para cultivo de tejidos vegetales
1. Esterilización de recipientes y medios de cultivo
Placas de Petri, ropa de trabajo, mascarillas, gorros, etc. Se puede esterilizar a alta temperatura, generalmente usando 1,2 atmósferas durante 20-30 minutos; el tiempo de esterilización medio no debe ser demasiado largo, de lo contrario algunas sustancias son fáciles de descomponer y destruir, 1,2 atmósferas, 15 minutos es suficiente. Para desinfectar los instrumentos metálicos, generalmente se sumergen en etanol al 70% antes de su uso, luego se encienden sobre una llama para esterilizarlos y enfriarlos antes de su uso.
2. Esterilización de materiales vegetales
La esterilización de materiales vegetales es principalmente esterilización externa. El tipo y la concentración de desinfectantes y el tratamiento deben seleccionarse según la sensibilidad de los materiales a los desinfectantes. La cantidad de tiempo. Primero, frote cuidadosamente los materiales de prueba en una solución de jabón en polvo y enjuáguelos con agua corriente, y luego esterilícelos de acuerdo con los métodos y secuencias que se enumeran en las tablas 13-1 y 13-2.
Tabla 13-1 Comparación de los efectos de los esterilizadores de uso común
Tabla 13-2 Secuencia de esterilización de diferentes órganos vegetales (3) Medio básico para el cultivo de tejidos vegetales
1. Composición del medio de cultivo
El medio de cultivo de tejidos vegetales suele estar compuesto por las siguientes sustancias (Tabla 13-3):
Tabla 13-3 La composición de varios cultivos de uso común. media (unidades: mg/L)
(1) Nutrientes inorgánicos
Los nutrientes inorgánicos incluyen macroelementos y oligoelementos. Además del carbono (C), el hidrógeno (H) y el oxígeno (O), el elemento más abundante es el nitrógeno (N). El nitrógeno nitrato o el nitrógeno amonio se usan generalmente como nitrógeno, pero el nitrógeno nitrato se usa a menudo en cultivo y el nitrógeno nitrato y el nitrógeno amonio también se usan en combinación. El fosfato se usa comúnmente para el fósforo y el sulfato para el azufre. El potasio es el catión principal y el calcio (Ca), el sodio (Na) y el magnesio (Mg) se requieren en cantidades menores. Las proporciones de los macroelementos suelen modificarse según la receta de la solución de Knop para el cultivo de plantas enteras. En general, los medios nutritivos deben contener al menos 25 mmol de nitrato y 25 mmol de potasio. Cuando el contenido de amonio excede los 8 mmol, suele ser tóxico para el cultivo. Pero para el cultivo de callos convencional y el cultivo en suspensión celular, la concentración de nitrato de amonio se puede aumentar a 60 mmol. Las concentraciones de calcio, azufre y magnesio están en el rango de 1 a 3 mmol. El cloruro de sodio necesario lo proporcionan sales de calcio, fosfatos o micronutrientes. Los oligoelementos incluyen yodo (I), boro (b), manganeso (Mn), zinc (Zn), molibdeno (Mo), cobre (Cu), cobalto (Co) y hierro (Fe), de los cuales el yodo puede ser innecesario. .
(2) Fuente de carbono y energía
La mayoría de las células vegetales requieren entre un 2% y un 4% de sacarosa. En algunos cultivos de tejidos vegetales, la concentración de sacarosa llega al 7 o incluso al 15. %.
Las fuentes de azúcar pueden tener otras funciones en el medio de cultivo además de las fuentes de carbono y energía. La sacarosa también se puede sustituir por glucosa y fructosa; otros azúcares son menos ideales. Puede que el mioinositol no sea esencial, pero se utiliza en grandes cantidades en medios de cultivo generales, posiblemente relacionado con su papel en la promoción del crecimiento de callos.
(3) Vitaminas
Entre varias vitaminas, el clorhidrato de tiamina (B1) puede ser necesario, mientras que la niacina y el clorhidrato de piridoxina (B6) solo pueden promover el crecimiento.
(4) Sustancias reguladoras del crecimiento
Las fitohormonas son componentes indispensables en el medio de cultivo y son responsables de la inducción del callo de las plantas, el crecimiento del cultivo, la diferenciación de órganos y la producción secundaria. tiene un impacto directo sobre el metabolismo de las sustancias. Generalmente se agregan dos hormonas al medio de cultivo: una es la auxina, las más utilizadas son 2,4-D, NAA, IAA, IBA, etc. El otro tipo son las citoquininas, las más utilizadas son la cinetina (Kt), la zeatina (Zt) y la 6-bencilpurina (6-BA). La concentración adecuada de 2,4-D es 10-7-10-5 mol, la concentración adecuada de IAA es 10-10-5 mol, la concentración más alta es 1-10 mg/L y el rango de concentración adecuado de NAA es superior a los dos anteriores. En circunstancias normales, sólo el 2,4-D (10-5-10-7mol) puede inducir con éxito el tejido calloso. Si se combinan auxinas como el 2,4-D con citoquininas, el efecto será aún mejor. Al inducir la diferenciación de los explantes en plantas, puede ser mejor utilizar ácido naftilacético en combinación con citoquininas. Entre las citoquininas, la cinetina y la 6-bencilpurina se utilizan ampliamente y pueden promover el crecimiento de callos. La concentración adecuada es 10-7-10-6 mol.
(5) Aminoácidos
El medio de cultivo debe incluir determinados aminoácidos, como la glicina. Además, la caseína hidrolizada se usa comúnmente en cultivos de tejidos y es una mezcla de aminoácidos. En particular, agregar una cierta cantidad de caseína hidrolizada al medio de diferenciación puede promover la embriogénesis y los poliembriones. Algunos aminoácidos son precursores de determinadas sustancias secundarias (como la fenilalanina y la ornitina, que son precursoras de la biosíntesis de los alcaloides de escopolamina). Añadiéndolos al medio de cultivo, se incrementará significativamente el contenido y la producción de dichas sustancias secundarias en el cultivo de tejidos.
(6) Aditivos orgánicos
La adición de algunos productos naturales al medio de cultivo es beneficiosa para la inducción y mantenimiento del callo, y también es beneficiosa para favorecer el crecimiento y la formación y acumulación de sustancias secundarias. Los más utilizados son la leche de coco, el extracto de levadura, el jugo de tomate y la harina de soja. Su rango de concentración: leche de coco 10 (vol/vol), extracto de levadura 0,5, jugo de tomate 5-10, harina de soja 0,1-0,5. Para estos aditivos naturales existe una tendencia a elegir compuestos sintéticos completamente conocidos en la preparación de medios de cultivo porque su composición es compleja y es difícil garantizar la consistencia.
2. Preparación del medio de cultivo
(1) Agua y medicamentos
Lo mejor es utilizar agua destilada de sales desmineralizadas en un recipiente de vidrio para prepararlo. medio de cultivo. Los productos químicos utilizados deben ser puros. Preferiblemente, los reguladores de crecimiento se recristalizan antes de su uso. Los hidrolizados de proteínas se hidrolizan mejor con enzimas para que los aminoácidos puedan conservarse mejor en su estado natural.
(2) Licores madre (solución madre)
Una forma sencilla de preparar medios de cultivo es preparar primero una serie de licores madre. Las sales minerales masivas (macroelementos) se pueden formular para que sean 10 veces más espesas que la concentración utilizada. Al disolver sales minerales, trate de escalonar Ca2, SO2-4- y PO3-4 para evitar la formación de materias insolubles como sulfato de calcio y fosfato de calcio. Lo mejor es disolver la sal mineral en una cierta cantidad de agua destilada, luego agregarla en secuencia y finalmente agregar agua hasta un cierto volumen. Los oligoelementos se pueden convertir en una solución concentrada con una concentración de 100 a 1000 veces y almacenarse en el refrigerador junto con los macroelementos. Cada vitamina se puede preparar por separado y almacenar en un matraz volumétrico a una concentración de 0,2-1 mg/L. Las sales de hierro deben prepararse por separado (ver arriba). Las fitohormonas tienen diferentes requisitos cuando se formulan.
Pesar NAA, 2,4-D, IAA y otras sustancias auxínicas, disolverlas con una pequeña cantidad de etanol 95 y luego diluirlas hasta una cierta concentración con agua destilada, disolver las citoquininas con una pequeña cantidad de ácido clorhídrico 0,5 o 1 N; y luego agregue agua destilada a la concentración requerida; el ácido fólico se debe disolver en una pequeña cantidad de agua con amoníaco diluido, y luego se debe agregar agua destilada a la cantidad requerida de biotina que se puede disolver directamente en agua durante la preparación.
(3) Esterilización y almacenamiento a alta presión
Al preparar el medio de cultivo, saque varias soluciones madre, mézclelas según el volumen requerido y agregue temporalmente ingredientes adicionales como como sacarosa y hormonas, Calentar y mezclar el agar derretido con anticipación (no se agrega agar para el cultivo líquido), luego ajustar el valor del pH al valor requerido (entre 5,5 y 5,8) con una solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 N, y luego póngalos en recipientes de cultivo respectivamente. Esterilizar el medio de cultivo preparado en un autoclave a 120°C y 1,1 kg/cm2 durante 15-20 minutos. El medio de cultivo esterilizado se puede almacenar a temperatura ambiente (la temperatura óptima es 65438 ± 00 °C) y debe utilizarse en un plazo de dos semanas.
3. Características de varios medios de cultivo comunes
En los diferentes medios de cultivo, las sales inorgánicas generalmente varían mucho y, en ocasiones, tienen características propias debido a la adición de diferentes fuentes de nitrógeno. MS es un medio diseñado por Murashige, T. y Skoog, F. en 1962. Se han logrado logros notables en el cultivo sólido de callos inducidos, cultivo líquido en suspensión celular, embriones, puntas de brotes, segmentos de tallos y anteras, y en la investigación de morfogénesis. La cantidad y proporción de nutrientes inorgánicos en el medio MS son apropiadas y pueden satisfacer las necesidades nutricionales y fisiológicas de muchas células vegetales. Por tanto, en general, no es necesario añadir al medio de cultivo aditivos orgánicos, como hidrolizado de caseína, hidrolizado de levadura o agua de coco. En comparación con otros medios de cultivo, el medio de cultivo MS contiene mayores contenidos de nitrato, potasio y amonio, lo cual es su característica distintiva. Similares al medio MS son los medios LS (linsmailer, E.M. y Skoog, F.1965) y RM (Tanaka, 1964). Sus componentes básicos son los mismos que los del medio MS, excepto que el primero elimina la glicina, la vitamina B6 y la niacina, mientras que el medio MS. la dosis de NH4NO3 se aumentó desde este último a 4950 mg/m. En comparación con el medio MS, el medio White (1963) tiene una concentración de sal inorgánica más baja, pero también se usa ampliamente y tiene buenos efectos en el cultivo de embriones y el cultivo de tejidos en general. El medio B5 fue diseñado por Gamborg et al. Su principal característica es su bajo contenido en amonio, que puede inhibir el crecimiento de algunas plantas. El medio N6 está diseñado por el Instituto de Botánica, la Academia de Ciencias de China y la Academia de Ciencias Agrícolas de Heilongjiang, y también es un medio muy adecuado. Ha sido ampliamente utilizado en el cultivo de anteras y de tejidos de algunas plantas en mi país. Su composición es similar a la del B5, pero no contiene molibdeno. En Europa se utiliza ampliamente el medio de Heller (1953), que tiene un bajo contenido de sales inorgánicas y carece de sales de molibdeno, pero contiene níquel, aluminio y otros compuestos.
Por tendencia general, los medios modernos tienden a utilizar altas concentraciones de sales inorgánicas. Cuando se trata de la aplicación de nitrógeno, muchas personas usan una mezcla de nitrógeno nitrato y nitrógeno amónico, o simplemente nitrógeno nitrato. Existen pocos estudios sobre el papel de los oligoelementos. La mayoría de las fórmulas se acercan básicamente al medio MS. Estos oligoelementos ya han satisfecho las necesidades del crecimiento de callos y células en el cultivo de tejidos. Para las sales de hierro se suele utilizar una mezcla de FeSO4 y Na2-EDTA (agente quelante).
2. Aplicación del cultivo de tejidos y células vegetales en la producción de medicamentos
En los últimos años, debido a la destrucción artificial del medio natural, la recolección indiscriminada, el aumento de los costes laborales y la introducción de técnicas. y/o dificultades económicas con las plantas silvestres, los recursos vegetales se reducen drásticamente y es cada vez más difícil garantizar un suministro adecuado de plantas medicinales. Desde la década de 1960, la gente ha comenzado a aplicar la tecnología del cultivo de tejidos vegetales para estudiar la producción de medicamentos botánicos. En los últimos años, con el desarrollo de la biotecnología moderna, se ha cultivado con éxito un gran número de células vegetales, lo que ha abierto una nueva vía para la producción industrial de fármacos botánicos.
En comparación con el cultivo general de plantas enteras, el sistema de cultivo celular tiene muchas ventajas: (1) La producción de sustancias útiles se lleva a cabo en condiciones controlables, independientemente de las condiciones climáticas y del suelo, ahorrando tierra; ) El cultivo celular está libre de microorganismos y plagas; (3) El ciclo de crecimiento es corto, acortando el largo proceso de introducción, domesticación y reproducción de las plantas; (4) Se pueden llevar a cabo reacciones de transformación biológica específicas, se pueden explorar nuevas rutas sintéticas; y se pueden obtener nuevas sustancias útiles; (5) ) Al seleccionar nuevas líneas celulares y cambiar las condiciones de cultivo, se puede aumentar la productividad y reducir los costos de producción.
(1) Tecnología de cultivo celular y de tejidos vegetales
1. Inducción y cultivo de callos
El callo es el material básico para el cultivo celular y de tejidos vegetales, por lo que el La inducción y cultivo de callos es una de las tareas básicas del cultivo celular y de tejidos vegetales.
El procedimiento de trabajo de la inducción de callos es aproximadamente el siguiente:
(1) Selección de materiales vegetales (incluidos tipos y partes de plantas); (2) Preparación y desinfección de materiales (; 3) ) Selección y preparación del medio de cultivo; (4) Inoculación y cultivo;
Actualmente, muchas plantas han inducido callos con éxito, entre las que las dicotiledóneas son las más comunes y las monocotiledóneas las menos. Además, las gimnospermas, los helechos y los musgos también tienen ejemplos de éxito. Por lo tanto, se puede decir que todas las plantas multicelulares tienen el potencial de inducir callos con éxito. Las plantas dicotiledóneas tienen una amplia gama de usos prácticos y pueden desarrollar callos rápidamente. Varios tejidos de las plantas, como el cambium vascular, el parénquima de los órganos de almacenamiento, el periciclo de las raíces, el endospermo, los cotiledones, el tejido del mesófilo y el tejido del haz vascular, pueden formar callos en condiciones adecuadas.
La inducción de callos se realiza mayoritariamente en medios de cultivo sólidos. El cultivo sólido generalmente se realiza a 25-28°C y el subcultivo se realiza cada 4-6 semanas.
Los métodos de cultivo de callos generalmente se pueden dividir en cultivo sólido y cultivo líquido. Cultivo sólido significa agregar una cierta cantidad de coagulante (0,6-1,0 agar, etc.) al medio de cultivo, calentarlo para disolverlo, colocarlo en recipientes de cultivo y enfriarlo para obtener un medio de cultivo sólido. Los que no tienen coagulantes son medios líquidos.
El cultivo sólido es un cultivo estático. La ventaja es que es simple y conveniente. Solo requiere material de vidrio común. A diferencia del cultivo líquido con agitación, no requiere equipos mecánicos complejos como agitadores y lechos giratorios. ocupar menos espacio. Una pequeña cámara de cultivo puede albergar muchos recipientes de cultivo. Sin embargo, el cultivo sólido también tiene las siguientes desventajas: solo una parte de la superficie del callo está en contacto con el medio de cultivo, lo que resulta en un crecimiento desigual del callo, es deficiente el intercambio de gases en el tejido inferior en contacto con el medio de cultivo y se descargan sustancias nocivas durante el proceso; el proceso de crecimiento se acumula; cuando se colocan estáticamente, debido al efecto de la gravedad o la exposición desigual a la luz, el tejido se polariza y es difícil tener un grupo bastante consistente.
El cultivo líquido se puede dividir en dos tipos: estático y agitado. El cultivo estático líquido es tan simple como el cultivo sólido y no habrá diferencia en la concentración de nutrientes en la solución de cultivo. Sin embargo, debido a las limitaciones de su uso, ahora rara vez se utiliza. El cultivo por oscilación implica la rotación continua de tejidos vegetales en un medio líquido, eliminando así las desventajas del cultivo estático. El cultivo con agitación se puede dividir en dos categorías: (1) inmersión continua, en la que el tejido se suspende en el medio de cultivo agitando o haciendo vibrar el medio de cultivo, y comúnmente se usa un agitador para el cultivo (2) para aquellos que se realizan regularmente; Como recipiente de cultivo se utilizan tubos en T sumergidos y biberones con tetina y se cultivan en un lecho giratorio. Durante la rotación, el cultivo aparece repetidamente en las fases líquida y gaseosa.
2. Cultivo en suspensión celular
La tecnología de cultivo en suspensión de células vegetales es una nueva tecnología de cultivo desarrollada sobre la base de la tecnología de cultivo líquido de callos. En las últimas dos décadas, el cultivo se ha desarrollado desde un cultivo en suspensión en tubos de ensayo hasta un cultivo en fermentador de gran volumen, desde un cultivo discontinuo a un cultivo semicontinuo y continuo, y en los últimos años, los últimos métodos de constante de turbidez y de constante química han logrado la automatización. en el control continuo a gran escala. Las características del cultivo en suspensión celular son: (1) Puede proporcionar una gran cantidad de células vegetales uniformes; (2) La proliferación celular es más rápida que la de los callos (3) Es adecuado para cultivos a gran escala; Por lo tanto, las células vegetales pueden cultivarse como microorganismos y usarse en la industria de la fermentación para producir algunos productos vegetales únicos, abriendo así una nueva vía para la producción industrial de productos vegetales.
El cultivo en suspensión celular consiste en cultivar células vegetales libres en un medio líquido. Sin embargo, debido a las características de agregación de las células vegetales, hasta el momento no es posible producir sólo células individuales libres en estado suspendido, sino a menudo pequeños grupos de células.
(1) Equipos y dispositivos de cultivo en suspensión
① Los agitadores se utilizan ampliamente en el cultivo en suspensión de células vegetales. El callo que se rompe fácilmente se puede dispersar en una suspensión celular dispersa agitando continuamente el agitador. También se puede utilizar para el subcultivo de células en suspensión.
(2) Gira la cama cada minuto. Como recipientes de cultivo se utilizan tubos en T o biberones con tetina.
③El estante de cultivo giratorio puede utilizar botellas más grandes como contenedores de cultivo.
④El equipo de cultivo continuo generalmente se basa en la introducción de aire comprimido estéril o aire y agitación continua para mantener la suspensión celular. En este dispositivo de agitación, dado que el recipiente para contener el líquido de cultivo es fijo, se puede conectar fácilmente al recipiente de cultivo un recipiente para almacenar líquido de cultivo fresco, un dispositivo de suministro de aire, etc. Puede instalar algunos tubos serpentinos en el recipiente de cultivo, colocar cables calefactores eléctricos en los tubos para calentarlos y pasar agua fría para enfriarlos. No es necesario instalar dichos dispositivos en una habitación a temperatura constante. Generalmente, este tipo de dispositivo puede controlar simplemente la temperatura, la velocidad de agitación, la velocidad de ventilación, la intensidad de la luz, la velocidad de entrada de la solución nutritiva, etc. , y a menudo conectado con electrodo de oxígeno, electrodo de pH, probador de densidad celular, etc. , formando un conjunto de dispositivos de cultivo continuo con control automático preliminar. Varios tipos de dispositivos de cultivo en masa de células vegetales incluyen dispositivos de fermentación agitados, dispositivos de fermentación que utilizan osciladores, dispositivos de fermentación que utilizan conductos e impulsores giratorios, dispositivos de fermentación agitados con burbujas y dispositivos de fermentación mediante puente aéreo.
(2) Medio para células en suspensión
El medio comúnmente utilizado adecuado para tejido de callo no es necesariamente el más adecuado para el cultivo de células en suspensión. El medio en el que normalmente se induce el callo se puede utilizar como punto de partida para determinar el medio más apropiado. Preste especial atención al efecto de la dosis de auxina y citoquinina sobre la agregación de células en cultivo en suspensión y elija un medio que facilite la disociación de las células.
En el cultivo en suspensión, el valor del pH a menudo cambia mucho, por lo que se deben agregar agentes quelantes como EDTA para que el hierro y otros iones estén disponibles durante mucho tiempo. Ajustar la proporción de nitrógeno nitrato a nitrógeno amónico también se puede utilizar como método para estabilizar el pH. Agregar algunos tampones sólidos, como hidrogenofosfato de calcio ligeramente soluble, fosfato de calcio insoluble y carbonato de calcio, también es un método para estabilizar el pH.
(3) Subcultivo de células en suspensión
Durante el proceso de cultivo en suspensión, los cambios en el crecimiento del número de células se muestran en la Figura 13-1. Básicamente una curva en forma de S. Hay una fase de retraso al principio, cuando las células rara vez se dividen seguida de una fase de crecimiento logarítmico, cuando el número de células aumenta rápidamente y la tasa de crecimiento permanece sin cambios; luego entrará en una fase estacionaria que se ralentiza gradualmente y finalmente la; La fase de crecimiento se detiene por completo. En cultivo, las células generalmente se subcultivan al comienzo del período de inactividad, algunas deben subcultivarse antes del período de inactividad cuando la proliferación se desacelera, y algunas incluso deben subcultivarse inmediatamente al final de la fase de crecimiento logarítmico para acelerar la célula. proliferación.
La figura 13-1 es un diagrama esquemático del crecimiento del número de células en una generación de cultivo.
En los últimos años, se han realizado estudios que utilizan inhibidores de la síntesis de ADN y tratamientos con hormonas vegetales para hacer que las células en cultivo entren en un determinado período del ciclo de división celular (como la fase G) bajo determinadas condiciones, y luego comiencen. A partir del siguiente período, la mayoría o todas las células se dividen sincrónicamente, lo que se denomina cultivo sincrónico. De esta manera, no sólo obtenemos una comprensión detallada de los verdaderos procesos del ciclo celular, sino también de los factores que controlan la secuencia de cambios bioquímicos de las células madre a las células hijas. Debido a que el cultivo sincrónico frecuentemente puede tomar muestras para análisis bioquímicos y citológicos, el volumen de muestreo puede ser grande y no afectará el crecimiento continuo de la población restante, proporcionando los medios técnicos necesarios para estudiar procesos importantes como el ciclo celular, la diferenciación celular y la metabolismo secundario Es otro avance importante en el desarrollo de la tecnología de cultivo de células vegetales.
En resumen, la tecnología actual de cultivo de células y tejidos vegetales ha evolucionado desde el cultivo sólido estático hasta el cultivo líquido, que se caracteriza por mejorar la nutrición y el suministro de oxígeno de los tejidos y células cultivadas. La escala y los métodos están evolucionando desde pequeñas cantidades hasta grandes cantidades, la aplicación está evolucionando desde tubos de ensayo hasta grandes tanques y cultivo simultáneo, y la operación está evolucionando de manual a automatizada. Estos avances y desarrollos han tenido un impacto significativo en las aplicaciones de investigación y producción de cultivos celulares y de tejidos vegetales.
(2) Ingredientes farmacéuticos producidos a partir de tejido vegetal y cultivo celular.
Desde que Bonner et al. estudiaron la producción de caucho natural a partir de callos de Echinacea en 1950, muchos investigadores han investigado mucho sobre qué sustancias útiles pueden producir los callos y cómo aumentar la producción de activos. ingredientes El trabajo ha logrado algunos resultados. Cada vez más personas creen que con los tejidos vegetales y las células cultivadas se pueden producir alcaloides, terpenos, quinonas, esteroles, enzimas, etc., que se utilizan para tratar diversas enfermedades, y que de los cultivos se pueden extraer péptidos y sustancias proteicas. Nickel (1980) concluyó que el cultivo de tejidos vegetales puede producir más de 50 compuestos y 28 productos potenciales. Zheng (1980) enumeró más de 60 ingredientes medicinales, plantas de origen y contenidos de medicamentos. Misawa, M., de Kyowa Hakko Co., Ltd., 1980, presentó los resultados de la investigación de sustancias fisiológicamente activas, incluidas enzimas como alcaloides, esteroles, terpenos y quinonas, producidas por laboratorios industriales o gobiernos mediante cultivo de tejidos vegetales. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud, existen 17 medicamentos básicos y más comunes que se extraen de plantas superiores. Entre ellas, las plantas fuente de 11 fármacos se han cultivado en tejidos (Tabla 13-4).
Tabla 13-4 Medicamentos esenciales y de uso común procedentes de plantas superiores
1. Alcaloides
Es particularmente difícil producir alcaloides a través de tejidos vegetales y cultivos celulares. Pero el cultivo de tejidos de plantas medicinales productoras de alcaloides es uno de los aspectos más estudiados (cuadro 13-5). Pero su contenido suele ser menor que en la planta original.
Tabla 13-5 Alcaloides en callos de plantas
Tabla 13-5 Alcaloides en callos de plantas (continuación)-1
(1) Alcaloides de escopolamina
Moisés, West, Chen, Mays, Masao Kijima, Bhandari, Thomas, Storrs, Sairam, Tabata, Hiraoka, Krioxi et al. Se han realizado extensas investigaciones sobre las raíces, los callos y las células en suspensión de plantas como la datura, la belladona, el jacinto y el ciempiés. , pero contienen pocas o ninguna sustancia medicinal. West (1957) confirmó por primera vez la presencia de alcaloides de escopolamina en los callos de la raíz de belladona. El contenido de atropina en el tejido del callo de la raíz es de 0,47 a 0,53. Sin embargo, no se detectó en callos de tallos y hojas. Chan et al. (1956) realizaron cultivos estáticos y con agitación en callos inducidos por diferentes órganos de Datura datura, Datura datura y Datura no tóxica, y midieron el contenido de alcaloides en los callos. Entre ellos, Datura y Datura tienen el mayor contenido en callos de semillas, alcanzando 0,016-0,056, en raíces 0,012-0,015, en tallos 0,004-0,014 y en hojas 0,007-0,067. Los resultados mostraron que la cantidad de alcaloides producidos era diferente debido a los diferentes órganos en los que se indujo el callo. West et al. también señalaron que existen diferencias en la capacidad de sintetizar alcaloides entre cepas de callos de Datura datura de la misma fuente. Zhi et al. (1976) determinaron preliminarmente que los contenidos de escopolamina y escopolamina eran 0,025 y 0,009 respectivamente, los cuales eran inferiores a los de la planta original (0,127 y 0,016 respectivamente). Sin embargo, debido a la investigación para mejorar las condiciones de cultivo, aumentar los nutrientes, reemplazar los reguladores del crecimiento y complementar los precursores, el contenido total de los dos alcaloides alcanzó 0,554 (0,139 en la planta original) y el contenido más alto de escopolamina alcanzó 0,495 (0,016 en la planta original). tallo), mejorado en 4 respecto al callo original. Los resultados de la investigación de Cheng Kedi et al. (1987) mostraron que células como la anisodamina no solo pueden producir alcaloides de tropina, sino que también convierten la escopolamina en anisodamina y escopolamina.
(2) Alcaloides piridinicos
En la investigación sobre el uso del cultivo de tejidos para producir alcaloides piridinicos, el tabaco es el primero y el más estudiado. Ya en 1948, Dawson estudió la biosíntesis de los alcaloides del tabaco. Su informe de 1960 mostró que en el cultivo de tejidos de tabaco viscoso, el contenido inicial de nicotina disminuyó drásticamente y, en el momento del callo típico, ya no quedaba nicotina. Sin embargo, Speake et al (1964) demostraron que las raíces, tallos y hojas del tabaco (variedad Virginia)