La reacción en cadena de la ligasa termoestable fue inventada por el profesor Lu Daru
Reacción en cadena de la ligasa termoestable Autores: Zhou Xiangda, Song Xiao, Huaicong, Sun Haiyan, Chen Hongyan, Lu Daru.
Ensamblar dos o más fragmentos de ADN según el diseño siempre ha sido un paso muy básico e importante en la investigación biológica. La tecnología de ligadura de ADN se utiliza ampliamente en campos tradicionales como la investigación de la función del exón y del promotor, la investigación de la función de las proteínas y la manipulación de genes. En la disciplina emergente de la biología sintética, la conexión del ADN se ha convertido en un paso central esencial para muchos estudios.
Aunque se han desarrollado una serie de métodos relacionados, incluida la tecnología clásica de enzimas de restricción tipo II y la tecnología de recombinación homóloga, todos tienen como objetivo obtener una mayor eficiencia, precisión, aplicabilidad y generalización. La tecnología todavía tiene muchas limitaciones en términos de ligadura de fragmentos de extremos romos, número de ligaduras únicas, longitud de la ligadura, dependencia del sitio de restricción y procesamiento de fragmentos, y todavía hay mucho margen de mejora.
La reacción en cadena de la ligasa termoestable (TLCR, por sus siglas en inglés), reacción en cadena de la ligasa termoestable, es un nuevo tipo de tecnología de ligadura de ADN desarrollada en este artículo. Esta tecnología utiliza la resistencia al calor y las propiedades de ligadura de la ADN ligasa Taq y coopera con un oligonucleótido auxiliar monocatenario en múltiples ciclos térmicos para lograr una ligadura específica de fragmentos objetivo y un crecimiento exponencial del producto.
Construimos un sistema de método experimentalmente insertando un fragmento de extremo de madera plano de 1 kb en el vector de manera direccional, y optimizamos el método desde tres aspectos: longitud del asistente, dosis del asistente y número de ciclos térmicos, y Probé una ligadura direccional única de múltiples fragmentos y capturó fragmentos específicos de sistemas mixtos no purificados.
La precisión y eficiencia del método se confirmaron y evaluaron mediante digestión enzimática, PCR, secuenciación y el número de clones formados por nanogramo de vector. Resultados: La tecnología TLCR puede insertar eficientemente un fragmento de extremo romo de 1 kb en un vector de 3 kb con una eficiencia de 151 clones por nanogramo de vector. Los resultados de la PCR, la digestión enzimática y la secuenciación muestran una tasa de precisión del 100%. secuencia y dirección específicas y no introduce mutaciones.
TLCR puede conectar 9 fragmentos diferentes con un tamaño de aproximadamente 1 kb en un plásmido circular completo con una longitud total de 8,9 kb en una sola reacción. En el experimento, también utilizamos tecnología TLCR para extraer de un material no purificado; el plásmido que contiene 7 Un fragmento de 1,5 kb se captura específicamente en el vector en un sistema híbrido de pequeños fragmentos del mismo tamaño. En los últimos experimentos, la tecnología TLCR puede capturar fragmentos de larga longitud del sistema híbrido con una eficiencia de no menos de 1; clon por nanogramo de vector. Fragmento de gen de hasta 27 kb.
El TLCR es adecuado tanto para fragmentos de extremos romos como para fragmentos con extremos salientes. Los fragmentos obtenidos mediante amplificación por PCR o digestión enzimática también pueden participar en la reacción y tienen un cierto grado de tolerancia a la secuencia homóloga. Continuaremos mejorando las capacidades de TLCR y explorando nuevas áreas de aplicación.
Conclusión La tecnología TLCR puede lograr de manera eficiente la ligadura direccional de fragmentos de ADN; tiene un rendimiento excelente en términos de número de fragmentos de ligación y longitud de ligadura; es única en la ligación de fragmentos de extremos romos y en la captura específica; de sistemas híbridos en; mayor grado de libertad que los métodos tradicionales.