¿Qué es un experimento de WB?

La detección de WB consiste en separar muestras de proteínas mixtas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y luego utilizar un sifón especial o un dispositivo de campo eléctrico para transferirlas a un portador de fase sólida (como una membrana de PVDF) y luego transferir la fase sólida a un portador de fase sólida (tal como una membrana de PVDF). La proteína o péptido en el portador de fase sirve como antígeno.

Unión específica al anticuerpo primario correspondiente, para luego unirse a la enzima o anticuerpo secundario marcado con isótopos, y finalmente detectar los componentes proteicos específicos expresados ​​por el gen diana mediante cromatografía de sustrato o autorradiografía.

El principio y el diagrama de flujo del experimento wb son los siguientes:

Preparación de la muestra de proteínas:

La muestra original puede ser células, tejidos, sobrenadantes de cultivo, inmunoprecipitados. o Para proteínas purificadas por afinidad, el siguiente es el método de procesamiento para la detección cualitativa de proteínas diana en muestras celulares. Para otros métodos de preparación de muestras, consulte la literatura relevante.

Notas:

1. Mezclar los dos reactivos A y B en cantidades iguales sobre un trozo de film transparente después de 1 minuto, colocar la proteína de la membrana hacia abajo y mezclar bien con la mezcla. contacto de la mezcla; después de 1 minuto, pase la película a otro trozo de film transparente, retire el líquido residual, envuélvala bien y colóquela en la rejilla para películas de rayos X.

2. En el cuarto oscuro, vierta 1× revelador y fijador en una bandeja de plástico, saque la película de rayos X bajo la luz roja y córtela en el tamaño adecuado (más grande que el largo y el ancho de). la película) con un cortador de papel 1 cm más grande).

Abra el soporte de la película de rayos X y coloque la película de rayos X sobre la película. Una vez colocada, no se puede mover. Cierre el soporte de la película de rayos X y comience a cronometrar adecuadamente; según la intensidad de la señal, generalmente es de 1 minuto o 5 minutos. También puede optar por presurizar la película varias veces en diferentes momentos para lograr el mejor efecto, después de completar la exposición, abra el soporte de la película de rayos X y tome. Saque la película de rayos X Una vez completada la exposición, abra el soporte de la película de rayos X y saque la película de rayos X. La hoja de luz se sumerge rápidamente en el revelador y el revelado se detiene inmediatamente después de que aparecen bandas obvias.

El tiempo de desarrollo es generalmente de 1 a 2 minutos (20 a 25°C). Cuando la temperatura es demasiado baja (inferior a 16°C), es necesario ampliar el tiempo de desarrollo inmediatamente después del desarrollo; sumerja la película de rayos X en el fijador, el tiempo de fijación es generalmente de 5 a 10 minutos, hasta que la película sea transparente; lave el fijador restante con agua del grifo y seque a temperatura ambiente.