Establecimiento de un modelo heterocigoto de células madre embrionarias de ratón con gen de osteoprotegerina eliminado
[Resumen] Objetivo Establecer un modelo heterocigoto de células madre embrionarias de ratón con gen knockout para osteoprotegerina (OPG) para sentar las bases para el establecimiento de un modelo animal con gen knockout para el desarrollo de fármacos contra la osteoporosis. Métodos Se amplificaron dos brazos homólogos mediante PCR y se insertaron dos fragmentos utilizados para la recombinación homóloga en el vector XpPNT para construir un vector dirigido a la desactivación del gen OPG. Después de la linealización y purificación, las células madre embrionarias de ratón se transdujeron mediante electroporación y se realizaron cultivos y cribados con doble fármaco con G418 y Ganciclovir. Se obtuvieron clones resistentes a doble fármaco y se extrajo el ADN genómico mediante PCR y métodos de hibridación Southern. identificar clones de células madre embrionarias recombinantes homólogas. Resultados Se obtuvieron 124 clones con doble resistencia a fármacos mediante cribado con doble fármaco y se identificó un clon de células madre embrionarias con recombinación homóloga mediante PCR e hibridación Southern. Conclusión En conclusión, este estudio obtuvo con éxito clones de células madre embrionarias de ratón heterocigotos OPG(-/), lo que sentó las bases para seguir obteniendo ratones knockout para el gen OPG mediante microinyección y reproducción reproductiva, y estudiando la función del gen OPG a nivel in vivo. También sentó las bases para permitir el establecimiento de modelos animales con genes knockout para el desarrollo de fármacos contra la osteoporosis.
[Palabras clave] inactivación del gen OPG; células madre embrionarias; osteoprotegerina; osteoporosis
Establecimiento del modelo heterocigótico de células ES inactivadas del gen OPG
QIAO Jian?ou , ZHOU Long?nv, NING Guang, et al. The 9th People?s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200232, China
[Resumen] Objetivo Obtener la célula madre embrionaria recombinante homóloga (célula ES) ) con su gen OPG desactivado. Métodos Se construyó un vector de dirección que apunta al exón 2 de OPG y una pequeña parte del intrón 2 con un fragmento Xbal/BamHI de 3,3 kb como brazo corto y un fragmento NotI/SalI de 3,9 kb como brazo largo después de dos brazos de homología. se obtuvo mediante PCR. El ADN del vector de direccionamiento linealizado y purificado se transfectó en células ES mediante electroporación y luego algunas de estas líneas de células ES sobrevivieron a la selección de G418 y Ganciclovir. Se expandieron e identificaron dos clones resistentes a fármacos mediante PCR y transferencia Southern. Se recolectaron un total de 124 clones resistentes a dos medicamentos y uno de ellos se confirmó como positivo. Conclusión El resultado de este experimento sentó las bases para el establecimiento adicional del modelo de ratón knockout para OPG y el estudio más profundo de OPG in vivo.
[Palabras clave] knockout; células ES; osteoprotegerina; osteoporosis
La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por una baja masa ósea y destrucción microestructural del tejido óseo, lo que resulta en enfermedades sistémicas que aumentan y causan fácilmente. Las fracturas también son enfermedades comunes que afectan la salud humana. Cómo establecer un modelo animal específico es un tema candente en campos relacionados. La osteoprotegerina (OPG) es una glicoproteína secretada descubierta en los últimos años que tiene la actividad de inhibir la diferenciación y resorción de osteoclastos [1]. Pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR).
Las investigaciones muestran que la OPG desempeña un papel importante en la patogénesis, la prevención y el tratamiento de la osteoporosis, la artritis reumatoide, la enfermedad de Paget y las enfermedades malignas del tejido óseo (osteosarcoma, tumor de células gigantes, cáncer metastásico). Este estudio utilizó métodos de clonación molecular para diseñar y construir un vector de direccionamiento dirigido a la mayor parte del segundo exón y parte del segundo intrón del gen OPG de ratón, y utilizó tecnología de direccionamiento de genes para eliminar el gen OPG de las células ES de ratón para su posterior desarrollo. La preparación del modelo de ratón con desactivación del gen OPG mediante microinyección sienta las bases.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales experimentales El plásmido vectorial pBluescriptⅠⅠ(/-) y el plásmido XpPNT fueron proporcionados por el Shanghai Southern Model Organism Center, y el vector de clonación del producto de PCR pGEM?Teasy fue proporcionado un producto de la empresa Promega. Se compraron varias enzimas de restricción, ADN ligasa T4, kits de etiquetado de ADN con cebador aleatorio, varias enzimas Taq, reactivos relacionados con la PCR y kits de RT?PCR de las empresas Takara y NEB. El marcador de ADN (escalera de 100 pb, escalera de 1 kb, fragmento Lamda-HindIII) se adquirió de las empresas NEB y Takara. La proteinasa K se adquirió de Shanghai Sangon Bioengineering Technology Service Company. Trizol se adquirió de GibcoBRL e Invitrogen. Se adquirieron kits de miniextracción de plásmidos de Huashun Bioengineering Company y Shanghai Sangon. El kit de extracción de plásmidos y el kit de extracción en gel (kit de extracción en gel rápido) se adquirieron de Qiagen. La solución de hibrización ExpressHyb se adquirió de Clontech. Los reactivos químicos convencionales se compraron principalmente de Sigma y China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Company. Los isótopos radiactivos [α-32P]-dCTP y [α-32P]-dATP son productos de Amersham Company. Reactivos relacionados con el cultivo celular: incluido medio líquido DMEM (alto nivel de glucosa, L?glutamina, sin piravato de sodio, certificado para células ES), aminoácidos no esenciales, glutamina, PBS sin Ca2/Mg2, PBS que contiene Ca2/Mg2, β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), suero fetal de ternera (calificado para células ES), G418, ganciclovir (GANC), dimetilsulfóxido (DMSO), penicilina/estreptomicina, tripsina (tripsina/EDTA), colágeno (gelatina) y otros reactivos son productos de Gibco? y Sigma, y LIF (ESGROTM) es un producto de CHEMICON (Australia). Las placas de cultivo celular de 35 mm, 100 mm, las placas de cultivo celular de 24, 48 y 96 pocillos, los tubos de centrífuga y otros consumibles para el cultivo celular son productos de Corning. Síntesis y secuenciación de cebadores: completadas por Shanghai Shenyou Biotechnology Company. Las secuencias de los cebadores las diseñamos nosotros mismos en función de los datos de la secuencia utilizando el paquete de software DNAstar. Líneas celulares ES: ratones pasados in vitro a la 13.ª generación. La línea celular CJ7 (de ratones Sv129) está conservada por la Oficina de Investigación y Enseñanza de Genética Médica de la Facultad de Medicina Básica de la Segunda Universidad Médica de Shanghai.
1.2 Método experimental
1.2.1 Construcción del vector de direccionamiento
1.2.1.1 Extracción de ADN genómico de células ES Coseche células ES en buenas condiciones y agregue la cantidad adecuada de solución de lisis y proteinasa K, durante la noche a 56°C, al día siguiente, centrifugar la muestra a temperatura ambiente a 12.000 rpm durante 10 minutos, tomar el sobrenadante, precipitar con etanol absoluto y lavar con etanol al 70% preenfriado en hielo; después del secado, disolver en una cantidad adecuada de agua pura y almacenar a 4°C para su uso posterior.
1.2.1.2 Obtener dos brazos de homología mediante el método de PCR. Comparar la secuencia de ADNc del gen OPG de ratón en Genebank (BLAST) para obtener la secuencia del gen OPG de ratón. De acuerdo con la secuencia proporcionada por NCBI GenBank, utilice Primerselect del software DNAstar para determinar dos pares de cebadores para los brazos de homología aguas arriba y aguas abajo. El cebador aguas arriba para el brazo de homología aguas arriba: CGTAGGATCCGTACCTCAGCCCTGAAGAT (correspondiente al gen OPG 14842-14861 pb); cebador: TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA (correspondiente al gen OPG 18152-18171bp); condiciones de PCR: 95 ℃, 5 min; 35 ciclos: 72 ℃, 10 min 4 ℃, siempre. El brazo de homología aguas arriba tiene una longitud de 3331 pb. El cebador aguas arriba del brazo de homología aguas abajo: ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT (correspondiente al gen OPG 18580 ~ 18598 pb) y el cebador aguas abajo: GTGGGCGGCCGCACAGCAGGACTGTCAACA (correspondiente al gen OPG 22478 ~ 22497 pb) las condiciones de PCR son: 95 ℃, 5 min; s 61,5 ℃, 50 s; 72 ℃, 4 min 35 ciclos: 72 ℃, 10 min 4 ℃, siempre. El brazo de homología aguas abajo tiene una longitud de 3918 pb.
1.2.1.3 Clonar correctamente el fragmento de ADN en el vector XpPNT. Recuperar los productos de PCR de los dos brazos de homología y conectarlos al vector de clonación de productos de PCR pGEM? El método convencional consiste en introducir el brazo de homología aguas abajo en el vector X?PpnT usando NotI/SalI, y luego insertar el brazo de homología aguas arriba en el vector X?PpnT que ya contiene el brazo de homología aguas arriba usando Xbal/BamHI. La identificación de la digestión enzimática y la determinación de la secuencia mostraron que la secuencia de conexión era correcta. El vector de direccionamiento se denominó 5-3opg-XpPNT, se linealizó mediante digestión con NotI, se recuperó y se almacenó a -20°C para su uso posterior.
1.2.2 Orientación del gen de células ES
1.2.2.1 Transferencia de genes por electroporación de células ES Tome 0,8 ml de suspensión de células individuales ES con una densidad de aproximadamente 1,2 × 107 / ml, agregue Ca2 y 0,1 ml de PBS que contiene Mg2 (que contiene aproximadamente 30 µg de NotI linealizado 5-3opg? En condiciones de temperatura normal, realice un disparo de pulso único con parámetros eléctricos de 240 V y 500 μF, luego vuelva a suspender en medio ES. Tome la suspensión celular e inocúlela en dos placas colagenizadas de 35 mm y use un medio no selectivo para recuperar. La detección de drogas se realizó 24 h después.
1.2.2.2 Selección de fármacos en células resistentes La selección de fármacos comienza 24 horas después de la transferencia genética por electroporación celular. Una de las placas de 30 mm se usó para cultivo celular selectivo usando medio de cultivo que contenía los fármacos selectivos G418 (concentración final: 400 g/ml) y Ganciclovir (concentración final: 2 mmol/L), y la otra placa todavía se usó para cultivos no celulares. -El cultivo celular selectivo sirvió como control. Después de 7 a 8 días de detección, los clones de células ES crecerán hasta convertirse en colonias de células visibles y podrán seleccionarse. Se seleccionaron 124 clones de células resistentes a los medicamentos en 14 días.