¿Quién puede explicarme en detalle el proceso de la tecnología PCR?
denominada PCR. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método de síntesis enzimática de fragmentos de ADN específicos in vitro. Consta de varias reacciones, como la desnaturalización a alta temperatura, el recocido a baja temperatura (renaturalización) y la extensión a temperatura adecuada. Haga que el ADN objetivo sea una amplificación rápida, una gran especificidad, una alta sensibilidad, un funcionamiento sencillo y un ahorro de tiempo. Puede utilizarse no sólo para investigaciones básicas como el aislamiento de genes, la clonación y el análisis de secuencias de ácidos nucleicos, sino también para el diagnóstico de enfermedades o en cualquier lugar donde estén presentes el ADN y el ARN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se conoce como clonación molecular libre de células o tecnología de amplificación enzimática guiada por cebador in vitro de secuencias de ADN específicas.
Edite para obtener una breve historia de este párrafo.
La investigación humana sobre los ácidos nucleicos ha superado los 100 años. A finales de los años 1960 y principios de los años 1970, la gente se dedicó a la investigación de la tecnología de aislamiento de genes in vitro. Sin embargo, la manipulación in vitro del ADN es algo limitada debido a su bajo contenido de ácido nucleico. Kolanna propuso por primera vez la idea de la amplificación de ácidos nucleicos in vitro en 1971. Sin embargo, en ese momento, el método de análisis de secuencia genética aún no estaba maduro, aún no se había encontrado una ADN polimerasa termoestable y la síntesis de cebadores oligonucleotídicos aún se encontraba en la etapa de síntesis manual y semiautomática. La idea parecía discutible. En 1985, el científico estadounidense Kary Mullis, inspirado por la autopista, inventó la tecnología PCR después de dos años de arduo trabajo y publicó el primer artículo académico sobre tecnología PCR en la revista Science. Desde entonces, la tecnología PCR ha sido ampliamente reconocida por la comunidad de las ciencias biológicas, y Kary Mullis ganó el Premio Nobel de Química del 65438 al 0993. Sin embargo, la tecnología de PCR inicial era bastante inmadura y era una tecnología de laboratorio compleja, costosa e “inútil”. A partir de 1988, Keohanog mejoró la fidelidad de la amplificación mejorando las enzimas utilizadas. Posteriormente, Zhaisi y otros extrajeron una ADN polimerasa resistente al calor de bacterias termófilas acuáticas que vivían en las aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone, lo que mejoró enormemente la eficiencia de amplificación de la tecnología de PCR. Precisamente gracias al descubrimiento de esta enzima, la tecnología PCR ha sido ampliamente utilizada y se ha convertido en la piedra angular fundamental del análisis genético y de la biología molecular. En las décadas siguientes, los métodos de PCR han ido mejorando continuamente: desde métodos de análisis cualitativo hasta determinación cuantitativa; desde la amplificación original de genes de unas pocas kb, hasta ahora se pueden amplificar fragmentos de ADN de decenas de kb. Hasta ahora, existen más de una docena de técnicas de PCR, como la combinación de PCR con transcriptasa inversa para convertirse en PCR de transcripción inversa y la combinación de PCR con anticuerpos para convertirse en PCR inmune.
Principios técnicos para editar este párrafo
La replicación semiconservativa del ADN es una forma importante de evolución y generación biológica. El ADN de doble cadena se puede desnaturalizar y fundir en cadenas simples bajo la acción de varias enzimas. Con la participación de la ADN polimerasa y el promotor, se puede copiar en la misma bimolécula según el principio del apareamiento de bases complementarias. En la reacción en cadena de la polimerasa
Los experimentos descubrieron que el ADN puede desnaturalizarse y fundirse a altas temperaturas, y puede renaturalizarse en dobles hebras cuando se enfría. Por tanto, la desnaturalización y renaturalización del ADN se puede controlar cambiando la temperatura, diseñando cebadores como promotores, añadiendo ADN polimerasa y dNTP y completando la replicación de genes específicos in vitro. Sin embargo, la ADN polimerasa estará inactiva a altas temperaturas, por lo que es necesario agregar una nueva ADN polimerasa en cada ciclo, lo que no solo es engorroso de operar, sino también costoso, lo que restringe la aplicación y el desarrollo de la tecnología de PCR. El descubrimiento de la enzima ADN polimerasa termoestable Taq supuso un hito en las aplicaciones de PCR. La enzima puede soportar altas temperaturas superiores a 90°C sin perder actividad, lo que hace que la tecnología de PCR sea muy simple y reduce en gran medida los costos. La tecnología de PCR se ha utilizado ampliamente y se ha aplicado clínicamente gradualmente.
El principio de funcionamiento de la edición de este párrafo
Similar al proceso de replicación natural del ADN, su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-hibridación (renaturalización)-extensión: ① Desnaturalización del ADN molde: reacción en cadena de la polimerasa cuando el ADN molde se calienta a aproximadamente 94 °C.
Después de eso, el ADN bicatenario del ADN plantilla o el ADN bicatenario formado por amplificación por PCR se disocia, de modo que pueda combinarse con el cebador para prepararse para la siguiente ronda de reacción; (2) La relación entre el ADN molde y el cebador Recocido (renaturalización): después de que el ADN molde se calienta y se desnaturaliza en una sola hebra, la temperatura se enfría a aproximadamente 40-60 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria. de la cadena simple del ADN plantilla; ③ Extensión del cebador: conjugado plantilla-cebador de ADN, se polimeriza en el ADN. Bajo la acción de la enzima, a aproximadamente 72 °C, se utiliza dNTP como materia prima de la reacción y la secuencia objetivo se utiliza como base. plantilla De acuerdo con los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa, se sintetiza una nueva cadena de replicación semiconservadora complementaria a la cadena de ADN plantilla y se repite el ciclo para la desnaturalización. Los tres procesos de hibridación y extensión pueden obtener más. "cadenas de replicación semiconservadoras", y esta nueva cadena puede usarse como plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas.
Editar las características de la reacción de este párrafo
Los determinantes específicos de las reacciones de PCR de alta especificidad son: ① la combinación específica y correcta de cebadores y ADN molde ② el principio de emparejamiento de bases; ③ Taq La autenticidad de la reacción de síntesis de la ADN polimerasa; ④ La especificidad y conservación del gen objetivo. La combinación correcta de cebadores y plantilla es clave. La unión del cebador al molde y la extensión de la cadena del cebador siguen el principio de apareamiento de bases. Debido a la fidelidad de la reacción de síntesis de la polimerasa y la resistencia a altas temperaturas de la ADN polimerasa Taq, la combinación (renaturalización) de la plantilla y los cebadores en la reacción se puede llevar a cabo a una temperatura más alta, la especificidad de la combinación aumenta considerablemente. y el gen objetivo amplificado es Los fragmentos pueden mantener una alta precisión. Al seleccionar regiones genéticas objetivo con alta especificidad y conservación, la especificidad será mayor. La cantidad de productos de PCR con alta sensibilidad aumenta exponencialmente y la plantilla inicial que se va a probar se puede amplificar desde el nivel de picogramos (pg=10-12) hasta el nivel de μg=10-6. Se puede detectar una célula diana entre 654,38+0 millones de células; en la detección de virus, la sensibilidad de la PCR puede alcanzar 3 RFU (unidades formadoras de placa), la tasa de detección más baja es de 3 bacterias; Reacciones de PCR simples y rápidas utilizando ADN polimerasa Taq de alta temperatura. Después de agregar la solución de reacción de una vez, la reacción de desnaturalización-hibridación-extensión se realiza en la solución de amplificación de ADN y en un baño de agua. La reacción de amplificación generalmente se completa en 2 a 4 horas. Los productos de amplificación generalmente se analizan mediante electroforesis, que no requiere isótopos, por lo que no hay contaminación radiactiva y es fácil de promover. La pureza de la muestra es baja y no es necesario aislar virus o bacterias ni cultivar células. Se pueden utilizar ADN y ARN crudos como plantillas de amplificación. Puede usarse directamente para la amplificación de ADN y la detección de muestras clínicas como sangre, líquido de cavidades corporales, enjuague bucal, cabello, células y tejidos vivos.
Edite los cinco elementos de este párrafo
Hay cinco sustancias principales involucradas en la reacción de PCR, a saber, cebadores, enzimas, dNTP, plantillas y cebadores de Mg2+. Los cebadores son la clave para la reacción específica de la PCR. La especificidad de los productos de la PCR depende del grado de complementariedad entre los cebadores y el ADN molde. Teóricamente, siempre que se conozca la secuencia de cualquier ADN molde, se pueden diseñar cadenas de oligonucleótidos complementarias basadas en ella como cebadores para amplificar el ADN molde in vitro mediante PCR. El diseño de los cebadores debe seguir los siguientes principios: ① Longitud del cebador: 15-30 pb, normalmente alrededor de 20 pb. ② Intervalo de amplificación del cebador: 200-500 pb es apropiado y puede amplificarse a un fragmento de 10 kb bajo ciertas condiciones. ③ Bases de cebador: el contenido de G+C debe ser del 40 al 60%. Muy poco G+C no favorece la amplificación y demasiado G+C puede producir fácilmente bandas no específicas. Los ATGC se distribuyen preferentemente de forma aleatoria para evitar agrupaciones de más de 5 nucleótidos de purina o pirimidina. (4) Evite las estructuras secundarias en los cebadores y evite la complementariedad entre dos cebadores, especialmente la complementariedad en el extremo 3'; de lo contrario, se formarán dímeros de cebadores y se producirán bandas de amplificación no específicas. ⑤Las bases en el extremo 3' del cebador, especialmente la última y penúltima base, deben coincidir estrictamente para evitar que las bases terminales no coincidan y provoquen fallas en la PCR. ⑥ Hay o puede haber un sitio de restricción adecuado en el cebador. Lo mejor es que la secuencia diana amplificada tenga un sitio de restricción adecuado, lo cual es muy beneficioso para el análisis de restricción o la clonación molecular. ⑦ Especificidad del cebador: el cebador no debe tener ninguna homología obvia con otras secuencias en la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos. Cantidad de cebador: la concentración de cada cebador es de 0,1 ~ 1 umol o 10 ~ 100 pmol. La cantidad más baja de cebador produce mejor los resultados deseados. Las concentraciones más altas de cebadores pueden causar desajustes y amplificación inespecífica, lo que aumenta la posibilidad de que se formen dímeros entre los cebadores.
Edite el sistema de reacción y las condiciones de reacción en este párrafo.
Sistema de reacción de PCR estándar: 10 × tampón de amplificación 10 ul cuatro mezclas de dNTP, cada mezcla contiene 200 μm ol/L de cebador 10 ~ 100 pmol ADN molde 0,1 ~ 2 ug ADN polimerasa Taq 2,5 u Mg2 +1,5 mmol/L Añadir el doble o el triple de partes de agua destilada a 100 ul. Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco sustancias principales involucradas en la reacción de PCR, a saber, cebadores, enzimas, dNTP, plantillas y tampones (requiere Mg2+).
Seleccione las condiciones de reacción de PCR para editar este párrafo
Las condiciones de reacción de PCR son temperatura, tiempo y número de ciclos. Ajuste de temperatura y tiempo: según el principio de PCR, se establecen tres puntos de temperatura: desnaturalización-recocido-extensión. En la reacción estándar, se utiliza el método de los tres puntos de temperatura. El ADN de doble cadena se desnaturaliza a 90 ~ 95°C y luego se enfría rápidamente a 40 ~ 60°C. Después de la hibridación, el cebador se une a la secuencia objetivo y luego se calienta rápidamente a 70 ~ 75 °C. La cadena del cebador se extiende a lo largo de la plantilla mediante la ADN polimerasa Taq. Para genes diana más cortos (de 100 a 300 BP de longitud), se puede utilizar un método de punto de temperatura dual, que puede combinar temperaturas de recocido y extensión además de la temperatura de desnaturalización. Generalmente, se desnaturaliza a 94 °C y se recoce y extiende a aproximadamente 65 °C (a esta temperatura, la Taq DNasa todavía tiene una alta actividad catalítica). ① Temperatura y tiempo de desnaturalización: la baja temperatura de desnaturalización y la fusión incompleta son las principales razones del fallo de la PCR. En términos generales, el tiempo a 93°C ~ 94°C es suficiente para desnaturalizar el ADN molde. Si es inferior a 93°C, es necesario ampliar el tiempo, pero la temperatura no puede ser demasiado alta, porque el ambiente de alta temperatura tiene un impacto en la actividad de la enzima. Si la plantilla del gen diana o el producto de la PCR no se pueden desnaturalizar completamente en este paso, la PCR fallará. ② Temperatura y tiempo de recocido (renaturalización): la temperatura de recocido es un factor importante que afecta la especificidad de la PCR. Después de la desnaturalización, enfríe rápidamente a 40 °C ~ 60 °C para permitir que los cebadores se unan a la plantilla. Debido a que el ADN molde es mucho más complejo que el cebador, la probabilidad de unión por colisión entre el cebador y el molde es mucho mayor que entre las hebras complementarias del molde. La temperatura y el tiempo de hibridación dependen de la longitud, la composición de bases y la concentración del cebador y la longitud de la secuencia diana. Para un cebador de 20 nucleótidos y un 50 % de contenido de G+C, 55 °C es un punto de partida ideal para seleccionar la temperatura de recocido óptima. La temperatura de renaturalización del cebador se puede utilizar para ayudar a seleccionar la temperatura adecuada mediante la siguiente fórmula: Valor Tm (temperatura de fusión) = 4 (G + C) + 2 (A + T) Temperatura de renaturalización = Valor Tm - (5 ~ 10 ℃) en Dentro del rango permitido del valor de Tm, elegir una temperatura de renaturalización más alta puede reducir en gran medida la unión no específica de los cebadores a la plantilla y mejorar la especificidad de la reacción de PCR. El tiempo de renaturalización es generalmente de 30 a 60 segundos, que es suficiente para combinar completamente el cebador y la plantilla. ③Temperatura y tiempo de extensión: Actividad biológica de la ADN polimerasa Taq: 70 ~ 80 ℃ 150 nucleótidos/segundo/molécula de enzima 70 ℃ 60 nucleótidos/segundo/molécula de enzima 55 ℃ 24 nucleótidos/segundo/molécula de enzima 90 ℃ Arriba, la síntesis de ADN es casi imposible. La temperatura de extensión de la reacción de PCR es generalmente de 70 ~ 75 ℃ y la temperatura común es de 72 ℃. Una temperatura de extensión excesivamente alta no favorece la unión de cebadores y plantillas. El tiempo de la reacción de extensión de la PCR depende de la longitud del fragmento a amplificar. Generalmente, para fragmentos de ADN de menos de 1 Kb, un tiempo de extensión de 1 minuto es suficiente. Una secuencia objetivo de 3 a 4 KB tarda de 3 a 4 minutos; la amplificación de 10 Kb debe ampliarse a 15 minutos. Una extensión excesiva puede provocar la aparición de bandas amplificadas inespecíficas. Para la amplificación de bajas concentraciones de plantilla, el tiempo de extensión es ligeramente mayor.
Editar la enzima y su concentración.
Hay dos tipos de ADN polimerasa Taq disponibles actualmente, uno es una enzima natural purificada de Bacillus hydrothermalis y el otro es una enzima genéticamente sintetizada por E. coli. Se requieren aproximadamente 2,5 U de enzima para catalizar una reacción de PCR típica (cuando el volumen total de reacción es de 100 ul). Si la concentración es demasiado alta, provocará una amplificación no específica, y si la concentración es demasiado baja, se reducirá la cantidad de producto sintetizado. La calidad y concentración de dNTP están estrechamente relacionadas con la calidad y concentración de dNTP y la eficiencia de la amplificación por PCR. El polvo de dNTP es granular y puede perder fácilmente su actividad biológica si no se almacena adecuadamente. La solución de DNTP es ácida y debe prepararse con NaOH 1 M o Tris 1 M después de una alta concentración. Ajuste el valor de pH del tampón HCL a 7,0 ~ 7,5, tome alícuotas de una pequeña cantidad y congele a -20 °C. La congelación y descongelación repetidas degradarán los dNTP.
En la reacción de PCR, el dNTP debe estar en 50 ~ 200 μmol/L, especialmente las concentraciones de los cuatro dNTP deben ser iguales (preparación equimolar). Si alguno de ellos es diferente de los demás (mayor o menor), habrá un desajuste. Una concentración demasiado baja reducirá el rendimiento de los productos de PCR. El DNTP puede combinarse con Mg2+ y reducir la concentración de Mg2+ libre. Ácido nucleico plantilla (gen diana) La cantidad y el grado de purificación del ácido nucleico plantilla son uno de los factores clave en el éxito de la PCR. Los métodos tradicionales de purificación de ADN suelen utilizar SDS y proteinasa K para digerir y procesar muestras. La función principal del SDS es disolver los lípidos y las proteínas de la membrana celular, disolviendo así las proteínas de la membrana, destruyendo la membrana celular y liberando las proteínas nucleares de las células. El SDS también puede unirse a proteínas y precipitar; la proteinasa K puede hidrolizar y digerir proteínas, especialmente histonas unidas al ADN, y luego usar solventes orgánicos fenol y cloroformo para extraer proteínas y otros componentes celulares, y usar etanol o isopropanol para precipitar ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos extraídos se pueden utilizar como plantillas para reacciones de PCR. En muestras clínicas generales, se puede utilizar un método rápido y sencillo para lisar células, lisar patógenos, digerir proteínas cromosómicas y liberar el gen objetivo para la amplificación directa por PCR. Las plantillas de ARN generalmente se extraen utilizando el método de isotiocianato de guanidinio o proteinasa K para evitar que la RNasa degrade el ARN. La concentración de Mg2+ tiene un impacto significativo en la especificidad y el rendimiento de la amplificación por PCR. En una reacción de PCR general, cuando la concentración de varios dNTP es de 200 μmol/L, la concentración apropiada de Mg2+ es de 1,5 ~ 2,0 mmol/L. Si la concentración de Mg2+ es demasiado alta, la especificidad de la reacción se reducirá y se reducirá. se producirá un aumento no específico. Si la concentración es demasiado baja, se reducirá la actividad de la ADN polimerasa Taq y también se reducirán los productos de reacción.
Editar este paso de trabajo.
Proceso básico de reacción de PCR
El proceso de PCR estándar se divide en tres pasos (como se muestra en la figura): 1. Desnaturalización del ADN (90 ℃ -96 ℃): bajo la acción del calor, los enlaces de hidrógeno de la plantilla de ADN bicatenario se rompen para formar ADN monocatenario 2. Recocido (renaturalización) (40 ℃ -65 ℃): El La temperatura del sistema disminuye y los cebadores se combinan con la plantilla de ADN para formar dobles hebras locales. 3. Extensión (68 ℃ -75 ℃): bajo la acción de la enzima Taq (la mejor actividad es alrededor de 72 ℃), dNTP se utiliza como materia prima para extender desde el extremo 5' del cebador hasta el extremo 3' para sintetizar. una hebra complementaria a la plantilla de las hebras de ADN. Después de cada ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión, el contenido de ADN se duplica. En la actualidad, algunas PCR se pueden replicar en poco tiempo porque la región de amplificación es muy corta, incluso si la actividad de la enzima Taq no es óptima. Por lo tanto, se puede cambiar a un método de dos pasos, es decir, el hibridación y la extensión. Realizado simultáneamente a 60 °C-65 °C para reducir un paso. Los procesos de calentamiento y enfriamiento aumentan la velocidad de reacción.
Edita los parámetros del bucle de este párrafo.
1. Desnaturalización inicial. La desnaturalización completa del ADN molde es fundamental para el éxito de la PCR y normalmente se calienta a 95 °C durante 3 a 5 minutos. 2. La temperatura de recocido del imprimador generalmente se determina mediante experimento (experiencia). La temperatura de recocido tiene un gran impacto en la especificidad de la PCR. 3. Extensión del cebador La extensión del cebador generalmente se realiza a 72 °C (la temperatura óptima de la enzima Taq). El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento amplificado y de la eficacia de amplificación de la enzima Taq utilizada. 4. Paso de desnaturalización en el ciclo: Generalmente, 95°C durante 30 segundos es suficiente para desnaturalizar completamente las diversas secuencias de ADN diana en el ciclo: un tiempo de desnaturalización demasiado largo destruirá la actividad de la enzima, y un tiempo de desnaturalización demasiado corto destruirá la actividad de la enzima. no desnaturaliza completamente la secuencia objetivo, lo que fácilmente puede provocar que falle la amplificación. 5. Número de ciclo: la mayoría de las PCR contienen entre 25 y 35 ciclos, lo que tiende a producir una amplificación no específica. 6. Finalmente, después del último ciclo, mantenga la reacción a 72 °C durante 5 a 15 minutos para permitir que los cebadores se extiendan completamente y el producto monocatenario se hibride en productos bicatenarios. Preguntas frecuentes sobre PCR-PCR
Editar el tiempo de detección de electroforesis.
Generalmente dentro de las 48 horas, algunas son mejores que las pruebas de electroforesis el mismo día. Después de más de 48 horas, el patrón del cinturón se vuelve irregular o incluso desaparece. Los aspectos clave de una reacción de PCR falsamente negativa sin bandas de amplificación son ① la preparación del ácido nucleico molde, ② la calidad y especificidad del cebador, ③ la calidad de la enzima y ④ las condiciones del ciclo de PCR. Para encontrar las razones, también debemos analizar y estudiar los enlaces anteriores. Plantilla: ① La plantilla contiene proteínas, ② La plantilla contiene inhibidores de la enzima Taq, ③ Las proteínas de la plantilla no se han eliminado, especialmente las histonas en los cromosomas, ④ Se pierde demasiado durante el proceso de extracción y preparación de la plantilla, o fenol. es inhalado. ⑤El ácido nucleico plantilla no está completamente desnaturalizado.
Cuando la calidad de la enzima y los cebadores es buena, no hay banda de amplificación, lo que probablemente se debe a un fallo en la digestión de la muestra y en el proceso de extracción del ácido nucleico molde. Por lo tanto, para preparar un jugo digestivo eficaz y estable, el procedimiento debe ser fijo y no puede modificarse a voluntad. Inactivación enzimática: Es necesario sustituir la nueva enzima o utilizar la antigua y la nueva al mismo tiempo, y analizar si el falso negativo se debe a la pérdida o deficiencia de la actividad enzimática. Tenga en cuenta que a veces se olvida la enzima Taq o el bromuro de etidio. Cebadores: la calidad de los cebadores, la concentración de los cebadores y si las concentraciones de los dos cebadores son simétricas son razones comunes de falla de la PCR o bandas de amplificación insatisfactorias, que son fáciles de dispersar. Existen problemas con la calidad de la síntesis de cebadores en algunos lotes. Uno de los dos cebadores tiene una concentración alta y el otro tiene una concentración baja, lo que da como resultado una eficiencia de amplificación asimétrica baja. Las contramedidas son las siguientes: ① Seleccionar buenos cebadores para sintetizar una sola posición. ②La concentración de los cebadores depende no solo del valor de DO, sino también de la electroforesis en gel de agarosa de la solución madre del cebador. Debe haber una banda de cebador y el brillo de las dos bandas de cebador debe ser aproximadamente el mismo. Por ejemplo, si un cebador tiene una banda y el otro no, la PCR puede fallar. Deberá negociar con la unidad de síntesis de cebadores para resolver el problema. Si una imprimación tiene un brillo alto y otra tiene un brillo bajo, equilibre las concentraciones al diluir la imprimación. (3) Los imprimadores deben almacenarse en paquetes pequeños de alta concentración para evitar que se deterioren debido a la congelación y descongelación repetidas o al almacenamiento prolongado en el refrigerador. ④El diseño del cebador no es razonable. Si la longitud del cebador no es suficiente, se formarán dímeros entre los cebadores. Concentración de Mg2+: la concentración de iones Mg2+ tiene un gran impacto en la eficiencia de la amplificación por PCR. Una concentración demasiado alta reducirá la especificidad de la amplificación por PCR, y una concentración demasiado baja afectará el rendimiento de la amplificación por PCR o incluso hará que la amplificación por PCR falle sin producir una banda de amplificación. Cambios en el volumen de reacción: Habitualmente, los volúmenes utilizados para la amplificación por PCR son 20ul, 30ul y 50ul. O 100ul. El volumen que se utilizará para la amplificación por PCR se establece en función de los diferentes propósitos de la investigación científica y las pruebas clínicas. Al fabricar volúmenes pequeños, como 20 ul, asegúrese de configurar las condiciones del modo; de lo contrario, fallará fácilmente.
Edita los motivos físicos de este párrafo.
La desnaturalización es muy importante para la amplificación por PCR. Si la temperatura de desnaturalización es baja y el tiempo de desnaturalización es corto, es probable que se produzcan falsos negativos; una temperatura de hibridación demasiado baja provocará una amplificación no específica y reducirá la específica. eficiencia de amplificación. Una temperatura de hibridación excesivamente alta afectará la unión de cebadores y plantillas y reducirá la eficiencia de la amplificación por PCR. A veces es necesario utilizar un termómetro estándar para detectar las temperaturas de desnaturalización, recocido y extensión en el amplificador o en el recipiente soluble en agua, lo que también es una de las razones del fallo de la PCR. Variación de la secuencia diana: si la secuencia diana está mutada o eliminada, lo que afecta la unión específica del cebador y la plantilla, o si el cebador y la plantilla pierden la secuencia complementaria debido a la eliminación de un determinado segmento de la secuencia diana, la La amplificación por PCR no tendrá éxito. La banda de amplificación por PCR falso positivo es consistente con la banda de la secuencia objetivo y, a veces, la banda es más clara y brillante. Diseño de cebador inadecuado: la secuencia de amplificación seleccionada tiene homología con la secuencia de amplificación no objetivo, por lo que al realizar la amplificación por PCR, el producto de PCR amplificado es una secuencia no objetivo. Si la secuencia objetivo es demasiado corta o el cebador es demasiado corto, pueden producirse falsos positivos. Es necesario rediseñar los cebadores. Contaminación cruzada de secuencias diana o productos de amplificación: Hay dos razones para esta contaminación: en primer lugar, la contaminación cruzada de todo el genoma o de fragmentos grandes conduce a falsos positivos. Este falso positivo se puede resolver manejándolo con cuidado y suavidad para evitar que la secuencia objetivo sea succionada por la pistola de carga o salpicada del tubo de centrífuga. Todos los reactivos o equipos, excepto las enzimas y sustancias que no pueden soportar altas temperaturas, deben esterilizarse en autoclave. Los tubos de centrífuga y las puntas de pipeta de inyección utilizados deben utilizarse una vez. Si es necesario, los tubos de reacción y los reactivos se irradian con luz ultravioleta antes de añadir la muestra para destruir los ácidos nucleicos presentes. El segundo es la contaminación de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos en el aire. Estos pequeños fragmentos son más cortos que la secuencia objetivo, pero tienen cierta homología. Se pueden empalmar entre sí y, después de ser complementarios de los cebadores, los productos de la PCR se pueden amplificar, lo que da como resultado falsos positivos, que pueden reducirse o eliminarse mediante PCR anidada. Aparecen bandas de amplificación inespecíficas. Las bandas después de la amplificación por PCR no coinciden con el tamaño esperado, ya sean grandes o pequeñas, o aparecen bandas de amplificación específicas y bandas de amplificación no específicas al mismo tiempo. Hay dos razones para la aparición de bandas no específicas: primero, los cebadores no son completamente complementarios a la secuencia diana, o los cebadores se agregan para formar dímeros. En segundo lugar, una concentración de iones Mg2+ demasiado alta y una temperatura de recocido demasiado baja están relacionadas con demasiados ciclos de PCR. El segundo es la calidad y cantidad de la enzima. A menudo, algunas enzimas de determinadas fuentes son propensas a formar bandas no específicas pero otras no. A veces, si la cantidad de enzima es demasiado alta, se producirá una amplificación no específica. La contramedida es: rediseñar la guía si es necesario. Reduzca la cantidad de enzima utilizada o reemplace la enzima de otra fuente. Reduzca la cantidad de cebadores, aumente la cantidad de plantilla de manera adecuada y reduzca el número de ciclos. Aumente la temperatura de recocido adecuadamente o utilice el método de punto de temperatura dual (desnaturalización a 93 °C, extensión del recocido a aproximadamente 65 °C).
Hay bandas de frotis o bandas de frotis en la amplificación por PCR y, a veces, aparecen bandas de frotis, bandas de frotis o bandas tipo alfombra. Las razones suelen ser demasiadas enzimas o una mala calidad de las enzimas, la concentración de dNTP es demasiado alta, la concentración de Mg2+ es demasiado alta, la temperatura de recocido es demasiado baja y el número de ciclos es demasiado. La contramedida es: reducir la dosis de enzima o reemplazar la enzima con otras fuentes. ②Reducir la concentración de dNTP. Reducir adecuadamente la concentración de Mg2+. Aumente el número de plantillas y reduzca el número de bucles.
Editar el producto de PCR de este clon.
1) ¿Cuáles son las mejores condiciones para clonar productos de PCR? La relación óptima de inserción:vector debe determinarse experimentalmente. 1:1 (inserto:vector) suele ser la proporción óptima, y también son aceptables proporciones molares de 1:8 u 8:1. Se debe determinar el rango de relación. Para la ligación, 5 ul de ligasa 2X, 50 ng de ADN plasmídico, 1 unidad Weiss de ligasa T4 y 10 ul de inserto***. Mantener la temperatura a temperatura ambiente durante 65.438 ± 0 horas, o a 4 °C durante la noche. A estas dos temperaturas, los vectores que carecen de proyección T se autoligan, produciendo puntos azules. Mantener la temperatura a temperatura ambiente durante 1 hora satisfará la mayoría de los requisitos de clonación. Para mejorar la eficiencia de la conexión, es necesario mantenerla a 4°C durante la noche. 2)2) ¿Es necesario purificar el producto de PCR en gel? Por ejemplo, el análisis en gel solo tiene una banda y no requiere purificación del gel. Si se ven bandas adicionales, es posible que el dímero haya acumulado una gran cantidad de cebador. Pequeñas cantidades de dímeros de cebador también tienen números molares elevados, lo que producirá una alta proporción de clones con dímeros de cebador en lugar del inserto objetivo. Por lo tanto, se requiere una purificación en gel antes de la clonación. 3) Si no se recupera el fragmento objetivo, ¿qué experimentos de control se necesitan? a) Revestimiento de células competentes no transformadas. Si hay colonias, significa que la ampicilina es ineficaz, que el plásmido resistente a la ampicilina está contaminado o que se producen colonias resistentes a la ampicilina. b) Transformar el plásmido completo, contar el número de crecimiento de colonias y determinar la eficiencia de la transformación. Por ejemplo, diluya 1 ug/ul de plásmido 1:100 y utilice 1 ul para transformar 100 ul de células competentes. Después de diluir hasta 1000 ul con SOC, esparcir 100 ul en la placa. Después de un cultivo nocturno, se generaron 1000 colonias. Tasa de transformación: número total de colonias producidas y número total de difusiones de ADN. La cantidad total de ADN sembrado es la cantidad utilizada en la reacción de transformación dividida por el factor de dilución. Específicamente, use 10 ng de ADN para la transformación, diluya a 1000 u con SOC para contener 10 ng de ADN, use 1/10 para la difusión, * *use 1 ng de ADN. Tasa de transformación: 1000 clones Las células susceptibles son susceptibles. c) Utilice el control positivo pGEM-T o el producto de PCR para producir >:20-40 puntos azules (usando el paso 10 especificado (octava potencia) ufc/ug de células competentes), lo que indica que el vector ha perdido T... posiblemente nucleasa contaminada con ligasa. . La ADN ligasa T4 (M1801, M1804, M1794) tiene buenos estándares de calidad y no se debe sustituir la ADN ligasa T4 de otras fuentes. d) Utilice el vector pGEM-T o pGEM-T Easy para transformar células competentes de alta frecuencia (10 (8ª potencia) ufc/ug. Según los procedimientos experimentales prescritos, se pueden obtener 100 colonias, el 60% de las cuales deben ser blancas). Manchas como >: 20-40 manchas azules, sin colonias o pocas colonias, problemas de conexión. 4) Los resultados del experimento de control fueron buenos, pero no se recuperó el fragmento objetivo. ¿Qué hay de malo en el experimento? a) La ligadura se puede mantener a temperatura ambiente durante 65438 ± 0 horas, lo que puede satisfacer a la mayoría de los clones. Para mejorar la eficiencia, es necesario mantenerlo a 4°C durante la noche. b) El fragmento insertado está contaminado, lo que produce la eliminación de 3'-T o la inhibición de la ligadura y la transformación. Por lo tanto, el fragmento insertado se mezcló con el control positivo pGEM-T y luego se ligó. Si se reduce el número de colonias en el control, es necesario purificar o preparar el inserto nuevamente. Si se produce una gran cantidad de puntos azules, significa que el fragmento insertado está contaminado por nucleasa, lo que provoca que se elimine la 3'-T del vector pGEM-T o pGEM-T easy. c) El fragmento insertado no es apto para la ligadura. A veces se producen inserciones purificadas en gel debido a una exposición excesiva a los rayos UV. Una irradiación UV excesiva producirá dímeros de pirimidina, lo que no favorece la ligación, y el ADN deberá purificarse nuevamente.
d) El producto de amplificación de la ADN polimerasa termoestable con función reparadora no tiene A en el extremo, que es necesario para la clonación del vector pGEM-T o pGEM-T Easy. Agregar Taq ADN polimerasa y nucleótidos puede agregar uno al final. Para obtener más información, consulte los datos técnicos del soporte pGEM-T pGEM-T Easy (TM042). e) Las secuencias muy repetitivas pueden ser inestables, lo que provoca deleciones y reordenamientos durante la amplificación. Si se descubre que las inserciones se eliminan y reorganizan con frecuencia, se debe utilizar una cepa de E. coli con recombinación deficiente, como las células SURE.
Editar la clasificación de esta reacción PCR.
PCR superpuesta
El método de empalme de genes de amplificación superpuesta es un método eficaz de fusión de genes y mutación dirigida al sitio basado en tecnología de PCR ordinaria. Como todos sabemos, los cebadores sólo necesitan unirse eficazmente al molde, especialmente la secuencia del extremo 5' no necesita estar completamente emparejada con el molde, por lo que se pueden agregar uno o incluso dos sitios de restricción al extremo 5' de la amplificación. cebador para facilitar la clonación posterior. El método SOEing aprovecha esta característica para mezclar nuevas secuencias en dos genes independientes para lograr el propósito de superponer regiones entre los dos genes. La combinación del extremo 3' hace posible la fusión de genes o la mutación dirigida al sitio.
Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa
RT-PCR es la abreviatura de PCR con transcripción inversa y PCR en tiempo real. La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es una variante ampliamente utilizada de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la RT-PCR, las cadenas de ARN se transcriben de forma inversa en ADN complementario, que luego se utiliza como plantilla para la amplificación del ADN por PCR.