Preparación de muestras mediante técnicas de inmunocitoquímica
Requisitos de inmunohistoquímica para muestras de tejidos y células
-Mantener la estructura y forma original de la muestra;
–Maximizar la retención del antígeno a analizar en actividad inmune situ (o anticuerpo) que no se apaga, se pierde, se dispersa ni se oculta.
El proceso de producción de muestras de células y tejidos de inmunohistoquímica es básicamente el mismo que los métodos de procesamiento convencionales, pero existen requisitos y precauciones especiales para el procesamiento de tejidos y células.
Debido a los diferentes contenidos y características de los distintos antígenos, a menudo existen diferentes requisitos para el procesamiento de muestras. Se debe seleccionar el método más adecuado para este experimento.
Muestras de tejidos y células utilizadas habitualmente en inmunohistoquímica
Muestras de tejidos
–Secciones en parafina
–Secciones congeladas
Muestras celulares
-Impresión de tejidos
–Secciones de cultivo celular (portaobjetos celulares)
Los frotis celulares y las secciones de parafina son las formas más comunes de preparar muestras de tejido y el método más básico.
La mayor ventaja es que la morfología del tejido está bien conservada y se puede seccionar en serie, lo que resulta conveniente para comparar y observar diversas tinciones;
–Los bloques de parafina también se pueden archivar para mucho tiempo para una investigación retrospectiva.
El proceso de preparación de secciones de parafina tiene un cierto impacto en la aparición de antígenos en los tejidos, pero se puede mejorar mediante algunas medidas, por lo que es la primera opción para preparar muestras de tejido en la mayoría de las inmunohistoquímicas.
1. Requisitos y precauciones especiales para los materiales
Frescura de la muestra: normalmente en 2 horas. Después de 2 horas, el tejido se autolizará en diversos grados y sus antígenos o desnaturalización desaparecerán o se dispersarán gravemente.
Sitio de muestreo: Además de la lesión o el sitio que contiene el antígeno a analizar, también se debe tomar la unión entre la lesión y el área normal, es decir, las secciones de tejido tomadas deben tener ambos antígenos. -áreas positivas y áreas negativas para formar un autocontrol.
-Tras la necrosis celular, el antígeno no sólo se difunde o desaparece, sino que también suele provocar tinciones inespecíficas, interfiriendo en la observación. Por lo tanto, trate de evitar áreas necróticas al tomar muestras.
1. Requisitos y precauciones especiales para los materiales (continuación)
Evite la extrusión: la extrusión del tejido puede cambiar la morfología de las células del borde y profundizar la coloración no específica al tomar materiales. una cuchilla afilada;
-Retire suavemente el tejido con unas pinzas;
-El tejido directamente sujeto por el espéculo a menudo se aprieta demasiado, así que tenga esto en cuenta al observar un poco los resultados. .
2. Fijadores y fijadores de uso común
Los tejidos después del muestreo deben colocarse en el fijador inmediatamente.
-La fijación puede coagular las proteínas de los tejidos y células, detener reacciones enzimáticas endógenas o exógenas, prevenir la autólisis o heterólisis de los tejidos, manteniendo así la estructura y forma original;
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–Para inmunohistoquímica, tiene la función de preservar el antígeno in situ para evitar la inactivación o dispersión del antígeno.
Fijadores habituales: Existen muchos tipos de fijadores, pero la mayoría son aldehídos y alcoholes. Sus principios de fijación son diferentes y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas.
–Aldehídos (formaldehído, glutaraldehído y paraformaldehído de uso común)
–Alcohol (etanol de uso común)
–Otros (acetona)
(1) Aldehído
El formaldehído (formalina) es el más utilizado
Principio: se forman enlaces cruzados entre las moléculas, afectando la configuración de la proteína y fijándola.
Ventajas: Estructura morfológica bien conservada, fuerte poder de penetración y menor contracción del tejido.
–Desventajas:
El formaldehído se puede oxidar a ácido fórmico si se deja demasiado tiempo, reduciendo el valor del pH de la solución y afectando la relación del teñido; entre el grupo aldehído y la proteína del antígeno el entrecruzamiento amino forma grupos carboximetilo, provocando obstáculos estéricos en la conformación tridimensional de los determinantes antigénicos;
La estructura reticular formada por el entrecruzamiento intermolecular puede enmascarar parcial o completamente ciertos determinantes antigénicos, lo que los hace incapaces de exponerse totalmente. Puede dar lugar a resultados de tinción falsos negativos.
–Nota:
Acorte el tiempo de fusión y baje la temperatura de fusión (4°C). Por lo tanto, el bloque de tejido no debe ser demasiado grueso.
Utilice formalina tamponada neutra y prepare un fijador de formaldehído al 10% con tampón fosfato con un valor de pH de 7,2 ~ 7,4 0,01 mol/L para reducir los cambios en el valor de pH del fijador.
Después de la fijación, lavar con agua para reducir el entrecruzamiento intermolecular.
Antes de la tinción inmunohistoquímica, las secciones se preprocesan para replicar el antígeno (recuperación de antígeno).
Glutaraldehído:
-Tiene una fuerte penetrabilidad y una estructura fina bien conservada, pero es resistente a la influencia de los antígenos. A menudo se utiliza en combinación con otros fijadores como fijador. microscopía inmunoelectrónica.
Paraformaldehído (normalmente 4):
–Se puede utilizar para microscopía inmunoelectrónica; también se puede utilizar para tinción por inmunofluorescencia.
Detecta principalmente algunos antígenos finos en los tejidos, especialmente antígenos de la superficie celular, como varios determinantes de diferenciación de ganglios linfáticos (CD) y antígenos mayores de histocompatibilidad.
(2) Alcoholes
El fijador de alcohol más utilizado es el etanol.
- Su función fijadora: precipitar proteínas y azúcares intracelulares.
Ventajas: fuerte permeabilidad y buena conservación de la antigenicidad.
–Desventajas:
Una deshidratación fuerte puede provocar fácilmente la contracción y el endurecimiento del tejido, afectando la calidad de las rodajas, por lo que el tiempo de fijación del etanol no debe ser demasiado largo (menos de 2 horas).
El etanol tiene un leve efecto desnaturalizante sobre las proteínas y puede disolverse nuevamente después de la fijación durante el proceso de tinción, el antígeno puede perderse debido a los largos tiempos de incubación, debilitando la intensidad de la reacción.
(3) Otros fijadores
Acetona:
-La antigenicidad se conserva mejor, pero provoca más deshidratación en las muestras de tejido y se utiliza menos, pero Cell Los portaobjetos suelen fijarse con acetona.
3. Recuperación de antígenos: motivos
Las muestras de cortes de parafina convencionales se fijan con formaldehído, lo que da como resultado:
–Las sustancias antigénicas forman enlaces aldehído y enlaces carboximetilo, Parte de los determinantes antigénicos quedan bloqueados;
-Los enlaces cruzados entre proteínas ocultan los determinantes antigénicos.
Requisitos: Durante la tinción, el antígeno debe repararse o exponerse primero, es decir, se deben destruir los enlaces cruzados formados entre las moléculas durante la fijación y se debe restaurar la forma espacial original del antígeno.
3. Recuperación de antígeno - método
Método químico
Método de calentamiento
–Método de calentamiento en baño de agua
– Método de radiación por microondas
–Método de calentamiento a alta presión
-Método de hidrólisis ácida
(1) Método químico
Los determinantes antigénicos principalmente pasan a través de algunos expuestos a través de la acción de enzimas. Las enzimas más utilizadas incluyen: tripsina, pepsina, etc.
–Tripsina: La concentración general es 0,05 ~ 0,1 y el tiempo de digestión es 37? c, 10 ~ 40 min, utilizado principalmente para la visualización de antígenos intracelulares;
–Pepsina: la concentración comúnmente utilizada es 0,1 ~ 0,4, el tiempo de digestión es 37? c, 30 ~ 180 min, utilizado principalmente para la visualización de antígenos intersticiales.
Por ejemplo, laminina y colágeno tipo IV
(2) Método de calentamiento por baño de agua
Coloque el portaobjetos en un recipiente que contenga una solución de recuperación de antígeno y caliéntelo hasta que hierva. durante 10 ~ 15 minutos.
Ventajas: funcionamiento sencillo y económico, apto para todos los laboratorios.
Desventajas: la exposición a epítopos muy cerrados no es la ideal.
(3) Método de radiación por microondas
Coloque el portaobjetos en un recipiente que contenga la solución de recuperación de antígeno, caliéntelo en un horno de microondas a más de 95 °C y consérvelo durante 10 a 10 minutos. 15 minutos después de enfriar, proceda según los pasos de tinción inmunohistoquímica.
Dado que las moléculas polares y los iones se mueven a alta velocidad en el campo de microondas e impactan las cadenas de red entrecruzadas, este método restablece el concepto de antígenos anormales a la normalidad y, debido al movimiento de las moléculas, se libera calor. generado con alta eficiencia y tiempo. Corto y eficaz contra la reproducción de antígenos.
(4) Calentamiento a alta presión para exponer antígenos.
Remojar el portaobjetos en la solución de recuperación de antígeno y meterlo en el autoclave durante 2 a 3 minutos. El efecto es excelente.
Debido al calentamiento uniforme a alta presión, es especialmente adecuado para teñir un gran número de muestras.
(1) Método de hidrólisis ácida
La hidrólisis ácida puede destruir los enlaces cruzados y exponer los antígenos.
Sumergir el portaobjetos de vidrio en solución de HCl 1mol/L y dejar actuar durante 20 minutos a temperatura ambiente (a medida que aumenta la temperatura el tiempo de acción se acortará).
Este método puede mejorar la tinción específica y reducir el fondo, pero cabe señalar que la hidrólisis excesiva destruirá la antigenicidad y la estructura morfológica.
Precauciones para los métodos de calentamiento
Alcanzar la temperatura especificada (92 ~ 95? C o superior
Mantenerla durante un tiempo determinado
;Evite secar las secciones (el antígeno puede perderse por completo);
Después del calentamiento, debe enfriarse naturalmente a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para permitir que las cadenas moleculares de proteínas desplegadas vuelvan a su configuración natural;
Solución reparadora:
–La más comúnmente utilizada es el tampón citrato de 0,01 mol/L con pH 6,0;
Las últimas investigaciones muestran que la reparación alcalina La solución es más eficaz y se recomienda un tampón EDTA de 1 mM (pH 8,0).
4. Procesamiento de portaobjetos de vidrio
Durante el proceso de recuperación del antígeno, la descamación se produce fácilmente debido a la influencia de diversos elementos sólidos, como la alta temperatura y la alta presión. Para evitar que los portaobjetos se caigan, a menudo se tratan con adhesivo.
–Si hay manchas de aceite en los portaobjetos nuevos, remójelos en líquido de lavado durante 12 a 24 horas, luego enjuáguelos con agua del grifo, luego enjuáguelos con agua destilada y séquelos con seda o con un secador; horno. A continuación, los portaobjetos limpios se tratan con adhesivo.
Los adhesivos más utilizados son:
–Simios (3-aminopropiltrietoxisilano)
–Ácido polilisina (polilisina)
–Gelatina de cromo Solución
3-Aminopropiltrietoxisilano
3-Aminopropiltrietoxisilano
p>Ya disponible. Utilice acetona pura o metanol para preparar 2 APES (v/v);
Remoje los portaobjetos limpios en el líquido durante 20 a 30 segundos;
Sáquelo y espere un momento. Después de un tiempo, limpie los simios libres con una solución pura de acetona-cetona y colóquelos en una campana extractora para que se sequen o a 60? Secado al horno.
Polilisina
Sumergir un portaobjetos limpio en 100? G/ml (10 p/v) de solución de polilisina (diluida con agua desionizada), 37? c 30 minutos, luego 60? c Hornear en el horno durante 1 hora o secar a temperatura ambiente durante la noche. Guárdelo en una caja para usarlo más adelante.
Solución de gelatina de cromo
Reactivo: 0,25g vitriolo de cromo) 0,25g
Gelatina) 2,5g
500 ml agua destilada
Primero, disolver alumbre de cromo en 40? c. Una pequeña cantidad de agua destilada, luego agregar gelatina y agua destilada. ¿Se puede utilizar a 70°? c. Disuelva la gelatina en un baño de agua, revuelva uniformemente antes de usar. Si queda algún residuo, se puede filtrar antes de su uso.
Al usarlo, derretir ligeramente, remojar las rodajas durante 2 a 3 minutos y secar durante la noche. La sección congelada se refiere al corte de tejido directamente en estado congelado.
El tejido no sufre ningún tratamiento químico ni proceso de calentamiento antes de seccionarlo.
–Reducir el tiempo de producción.
–No hay pérdida de antigenicidad.
Especialmente indicado para antígenos con poca estabilidad, como los antígenos de superficie de los linfocitos.
Durante la congelación de tejidos, el agua dentro y fuera de las células forma cristales de hielo. Cuanto más lenta sea la velocidad de congelación, más grandes serán las partículas de cristales de hielo, lo que afectará gravemente a la morfología y estructura de los tejidos y células. Por tanto, la producción de bloques congelados requiere bajas temperaturas y una congelación rápida.
1. Métodos comunes para congelar bloques de tejido
Congelación con nitrógeno líquido: coloque el tejido en nitrógeno líquido (a 196 °C) durante 10 ~ 20 segundos. > Agregue acetona (o isopentano) al hielo seco, el líquido se vaporiza inmediatamente y forma espuma, y la temperatura desciende a -70ºC. c. Coloque el tejido en un recipiente lleno de isopentano en acetona con hielo seco. Lo mejor es congelarlo en el recipiente.
–Durante el proceso de congelación rápida, el tejido mencionado anteriormente debe sumergirse en OCT; medio de inclusión o pasta de celulosa a base de formazán para proteger el tejido.
–Si es necesario almacenar bloques congelados, se deben envolver en papel de aluminio o película plástica y almacenar a -70ºC. c refrigerador.
2. Secciones finas
Las secciones congeladas utilizadas para inmunohistoquímica también requieren una unión suave y continua.
Los portaobjetos también deben estar limpios y libres de manchas de aceite, pero generalmente no se requiere adhesivo.
Utilice un microtomo de congelación a temperatura constante al cortar, y la temperatura dentro de la caja es; -25? C. ¿El grosor de la rebanada es generalmente de 4 ~ 8? m.
3. Postprocesamiento del rebanado
Cortar secciones congeladas y secar naturalmente a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas, luego colocarlas en 4? c. Fijar en acetona durante 65, 438 ± 00 min. Después del secado, realizar tinción inmunohistoquímica o sellar a -20 ℃.
Debido a los altos requisitos de la tecnología de corte, es difícil obtener buenas secciones continuas. Su estructura morfológica no es tan buena como la de las secciones de parafina, y los bloques y secciones congelados no son convenientes para el almacenamiento a largo plazo. por lo que la aplicación de secciones congeladas es limitada. Cuando cultive células adherentes, coloque la tapa en el matraz de cultivo para permitir que las células crezcan en la tapa. Después de alcanzar una densidad adecuada, retírela y fíjela (fije con acetona a 20 °C durante 10 a 20 minutos) y luego realice una inmunotinción.
–Los cubreobjetos se tratan de la misma forma que los portaobjetos, pero el tiempo de remojo es de 2 horas.
-Para evitar el desprendimiento celular se puede utilizar polilisina como tratamiento. La mayoría de los frotis celulares se elaboran a partir de suspensiones de células, que incluyen:
Sangre, orina y líquido cefalorraquídeo
–derrame de la cavidad corporal;
–aspiración y aspiración de tejido; , como la médula ósea, los ganglios linfáticos u otro tejido sólido.
–Suspensión formada por digestión de células en cultivo en suspensión o células adherentes. Método de frotis celular:
–Método de dibujo manual
Ajuste la concentración de células a aproximadamente 106/ml, que se puede aplicar directamente sobre el portaobjetos de vidrio, pero debe ser uniforme y no -superposición.
El diámetro del rango de la imagen debe ser inferior a 1cm para ahorrar reactivos.
–Método de recubrimiento con recubridor
Convierta la muestra de células en una suspensión celular de 2×105 ~ 6/ml, absorba 50 ~ 100? Se añadió L (1 ~ 2 × 104 ~ 5 células) a la máquina de frotis y, después de la centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos, las células se distribuyeron uniformemente en el portaobjetos de vidrio.