Método de preparación de la biopelícula de Listeria monocytogenes
Método de preparación de la biopelícula de Listeria monocytogenes:
1. Inocular la cepa congelada a -80°C en medio de cultivo sólido BHI y cultivarla a 37°C durante 18 horas para su activación. Elija una sola colonia y cultívela en 5 ml de medio BHI líquido durante la noche a 37 °C y 200 r/min. Al día siguiente, transfiera a 1 litro de medio BHI líquido fresco en una proporción de 1:100 y continúe cultivando hasta que la DO600 sea 1,0.
2.2.2 Extracción de vesículas de membrana mediante método de ultrafiltración y concentración. Cuando las bacterias se cultivan hasta que la DO600 sea 1,0, se centrifuga a 4 °C y 6000 r/min durante 20 minutos para recoger el sobrenadante y se filtra. Luego se transfieren los restos celulares y otras impurezas a un tubo de concentración de ultrafiltración con un corte de masa molecular relativa de 100 kD y se centrifugan a 4 °C y 4000 r/min durante 20 min. Tomar la solución concentrada, centrifugar a 4°C y 31174r/min durante 3 horas, descartar el sobrenadante y suspender el precipitado con 10 mL de tampón fosfato. Después de repetir la centrifugación una vez, resuspender el precipitado en 1 mL de tampón fosfato y. filtrarlo a través de un filtro de 0,22 μm. Prueba de esterilidad, identificar la esterilidad y luego almacenarlo a -80 ° C, que es la vesícula de membrana extraída. Las vesículas de membrana extraídas de EGDe, EGDeΔprfA y EGDeΔprfA+pERL3-prfA* se expresaron como EGDe-MV, ΔprfA-MV y prfA*-MV respectivamente.
3. Extraer las vesículas de membrana mediante centrifugación en gradiente de densidad Optiprep. La solución de centrífuga en gradiente Optiprep se prepara con DMEM en concentraciones del 25%, 30%, 35%, 40% y 45% respectivamente. Transfiera 1 ml de producto extraído por el método de concentración por ultrafiltración (igual que 1.2.2) a un tubo de centrífuga Beckman, luego agregue 2 ml de Optiprep al 45 %, 40 %, 35 %, 30 % y 25 % en secuencia e incube a 4 °C, 31174r/min para ultracentrifugación durante 15 h. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente entre el 30% y el 35% de los componentes en un tubo de centrífuga Beckman, agregue 10 ml de tampón fosfato y vuelva a realizar la ultracentrifugación. Repita la centrifugación tres veces y luego deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón fosfato. Filtrarlo a través de un filtro de 0,22 μm y realizar una prueba de esterilidad. Después de identificar la esterilidad, guárdelo a -80 °C para obtener la membrana extraída. vesículas.
4. Determine la concentración de proteínas de las vesículas de membrana mediante el método BCA y calcule el rendimiento de las vesículas de membrana. Para conocer el método de determinación específico de la concentración de proteínas de MV, consulte las instrucciones del kit de determinación de la concentración de proteínas de BCA. Utilice el método de extensión de la placa de dilución para contar el número de colonias cuando la OD600 es 1,0 y utilice la cantidad de proteína (μg) obtenida por 1013 UFC como productividad de las vesículas de membrana.
5. Observe la morfología de las vesículas de membrana bajo un microscopio electrónico de tinción negativa. Remoje la malla de cobre en la muestra de MV durante aproximadamente 20 minutos y luego sáquela con papel de filtro para hacer contacto vertical con la malla de cobre. eliminar el exceso de líquido. Luego, sumerja la malla de cobre en una solución de teñido de PTA durante 5 minutos, sáquela y séquela de forma natural en un lugar fresco durante 2 o 3 días, y luego úsela para observación con microscopía electrónica.
6. Efecto sobre la formación de biopelículas bacterianas. El cultivo y la detección de biopelículas bacterianas se basaron en el método de Feng Feifei et al. Después de diluir las MV de las tres cepas de bacterias a la misma concentración (0,2 mg/mL), agregue 100 μL de las MV correspondientes en una proporción 1:1 a una placa de 96 pocillos que contenga 100 μL de solución bacteriana (misma cepa o diferentes cepas). Configure dos conjuntos de referencias sin MV: un grupo agrega una cantidad igual de solución bacteriana y el otro grupo agrega una cantidad igual de tampón fosfato. Una vez completadas las operaciones anteriores, la placa de 96 pocillos se cultiva a 37°C durante 24, 48 y 72 horas respectivamente. Después de cultivar durante un período de tiempo correspondiente, se midió el valor de OD600 con un lector de microplacas para detectar su crecimiento; luego se descartó el medio de cultivo en cada pocillo y la biopelícula generada se lavó con agua destilada, se secó a temperatura ambiente y se tiñó. con violeta cristal de oxalato de amonio al 1% y mida su valor de absorción de luz OD595. Los datos experimentales obtenidos fueron analizados y procesados utilizando Origin8 y SPSS22. La biopelícula teñida con cristal violeta se observó directamente bajo un microscopio invertido y se fotografió para su registro.
7. Detección de la actividad hemolítica de vesículas de membrana. La determinación de la actividad hemolítica se basó en el método de Xinhui et al.
Después de diluir MV de diferentes cepas a la misma concentración (0,2 mg/ml), agregue una cierta cantidad de MV a un tubo de centrífuga que contenga 1 ml de suspensión de glóbulos rojos. Agregue una cantidad igual de tampón fosfato al grupo de control negativo y. agregue una cantidad igual de tampón fosfato al grupo de control positivo. Agregue una cantidad igual de agua estéril, agregue una cantidad igual de MV a 1 ml de suspensión de glóbulos rojos y luego agregue 2 mmol/LDTT. Después de incubar el tubo de centrífuga anterior a 37°C durante 3 horas, centrifugar a temperatura ambiente y 2600 r/min durante 5 minutos, absorber 800 μL del sobrenadante y medir el valor OD543 en una cubeta desechable, que es el valor de actividad hemolítica de MV.
8. Efectos de las vesículas de membrana sobre el peso corporal, la tasa de supervivencia, la tasa de pupación y el tiempo de desarrollo larval de las larvas del gusano del algodón. Seleccione las larvas del cuarto estadio con básicamente el mismo estado fisiológico y colóquelas en hielo para anestesia. durante 2 horas hasta su uso [13]. Después de diluir MV derivadas de diferentes cepas a la misma concentración (0,2 mg/mL), se pipetearon 5 μLm-MV y se inyectaron desde el primer pie ventral de las larvas. Se inyectó una cantidad igual de tampón fosfato en el grupo de control, con 18. larvas en cada grupo. Una vez completada la inyección, pese las larvas cada 24 horas y cuente la tasa de supervivencia, la tasa de pupación y el tiempo de desarrollo larvario (desde la fecha de compra hasta el último estadio). Los datos se calculan como: tasa de pupación = número de pupas/ número total de gusanos de prueba ×100% tasa de supervivencia = número de supervivientes/número total de insectos de prueba ×100%;