¿Cuál es el número de grupos amino de la superficie de la ovoalbúmina (OVA) y la BSA?

He realizado acoplamientos de moléculas pequeñas y proteínas, y tengo algunas reseñas que he resumido. Puedes consultar el. siguiente:

Soportes comúnmente utilizados para sintetizar antígenos artificiales

La superficie del soporte debe tener primero grupos químicamente activos que puedan acoplarse directamente con antibióticos o moléculas de pesticidas. Este es el requisito previo. acoplamiento químico para preparar antígenos; en segundo lugar, el portador debe tener una cierta capacidad. En segundo lugar, el vehículo debe tener una cierta capacidad y ser capaz de acoplar un número suficiente de moléculas; el vehículo también debe ser inerte y no debe interferir con la función de las moléculas acopladas y el vehículo debe tener suficiente estabilidad y debe ser barato y; fácil de obtener.

Las proteínas portadoras comúnmente utilizadas para sintetizar antígenos artificiales incluyen la albúmina sérica bovina (BSA), la ovoalbúmina (OVA), la hemocianina de lapa californiana (KLH), la albúmina sérica humana (HSA) y los polímeros sintéticos (PLL). Los grupos α y ε-amino (puntos isoeléctricos 8 y 10), el grupo fenólico, el grupo sulfhidrilo (punto isoeléctrico 9), el grupo imidazol (punto isoeléctrico 7) y el grupo carboxilo (punto isoeléctrico 2 a 4) en estas moléculas de proteínas son principalmente Los grupos β- y γ-carboxilo del ácido aspártico o del ácido glutámico) son reactivos en condiciones de pH isoeléctrico, parte de los cuales se protona y la otra parte del grupo nucleofílico no protonado es reactivo y puede reaccionar con un hapteno en un hapteno. Por supuesto, la reactividad de estos grupos también depende del microambiente de los distintos residuos de aminoácidos de la proteína. Las moléculas de albúmina sérica bovina (BSA) y albúmina sérica humana (HAS) contienen una gran cantidad de lisina, por lo que hay muchos grupos amino libres y pueden mantener una gran solubilidad bajo diferentes valores de pH y fuerzas iónicas. Además, los grupos activos de estas proteínas pueden mantener la solubilidad cuando se disuelven en disolventes orgánicos (como piridina, dimetilformamida), por lo que estas dos proteínas son las proteínas transportadoras más utilizadas [30]. En los últimos años, los estudios han informado que los péptidos sintéticos (más comúnmente polilisina) se han utilizado ampliamente como portadores porque pueden aumentar la inmunogenicidad de los haptenos, aumentando así la posibilidad de generar anticuerpos específicos de haptenos [31, 32].

1.2.2 Métodos de síntesis artificial de antígenos

El efecto de acoplar haptenos de moléculas pequeñas a proteínas portadoras se verá afectado por la concentración y la proporción relativa del agente de acoplamiento, y la eficacia de el agente de acoplamiento. La influencia de factores como la concentración y su cantidad relativa, la composición del tampón, su pureza y fuerza iónica, el valor del pH y la estabilidad, solubilidad y propiedades físicas y químicas del hapteno. Normalmente, las condiciones para la unión del hapteno y la proteína portadora en solución acuosa son relativamente suaves y no deben llevarse a cabo en condiciones de alta temperatura, baja temperatura, álcalis fuertes o ácidos fuertes. En términos generales, el grupo activo del hapteno determina el método de síntesis de acoplamiento. Los métodos comúnmente utilizados son los siguientes:

1.2.2.1 Acoplamiento de haptenos que contienen grupos carboxilo o haptenos carboxilables en la molécula

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1) Método del anhídrido mixto: también conocido como método del cloroformiato de isobutilo. El grupo carboxilo del hapteno reacciona con cloroformiato de isobutilo en presencia de n-butilamina para formar un intermedio de anhídrido mixto, que luego reacciona con el grupo amino de la proteína para formar un compuesto de unión entre el hapteno y la proteína

2 ) Método de carbodiimida (CDI): La carbodiimida (EDC) deshidrata los grupos hidroxilo y amino para formar un enlace amida, el grupo carboxilo del hapteno reacciona con EDC para formar un intermedio y el intermedio reacciona con el grupo amino del proteína para formar un hapteno Unión de compuestos a proteínas. Los grupos carboxilo de la proteína primero reaccionan con EDC para formar un intermedio, que luego reacciona con los grupos amino de la proteína para formar un conjugado hapteno-proteína (ver Figura 1.5). El EDC se conoce como uno de los entrecruzadores de longitud cero porque es un mediador para la formación de enlaces amida y no forma moléculas de brazo.

Este método de conexión es muy sencillo: simplemente mezcle la proteína transportadora y el antígeno en una solución adecuada en una determinada proporción, luego agregue carbodiimida soluble en agua, revuelva durante 1 a 2 horas y déjelo a temperatura ambiente durante. 24 horas, y luego Diálisis. Si la molécula de hapteno no contiene grupos carboxilo, ciertas reacciones químicas pueden introducir grupos carboxilo. Después de introducir el grupo carboxilo, el acoplamiento también se puede realizar usando el método anterior.

1.2.2.2 Acoplamiento de haptenos que contienen amino o que contienen nitro reductores

1) Método del glutaraldehído: Los dos grupos aldehído del reactivo bifuncional glutaraldehído se combinan con el hapteno y el amino. grupo de la proteína forma un enlace de Schiff (-N=C<, introduciendo así un puente de 5 carbonos entre el hapteno y la proteína.

Esta reacción se puede realizar en condiciones suaves de 4-40°C y pH 6,0-8,0 y es simple de operar, lo que la hace ampliamente utilizada. El glutaraldehído se ve afectado por la luz, la temperatura y la alcalinidad, y puede autopolimerizarse y debilitar el efecto de reticulación, por lo que es mejor utilizar glutaraldehído fresco.

2) Diazotización: se utiliza para haptenos cuyo grupo activo es un grupo amina aromática. El grupo amina aromática reacciona con NaNO2 y HCl para formar una sal de diazonio, que puede unirse directamente a la proteína en posiciones adyacentes. a los grupos carboxilo de los aminoácidos para formar compuestos azo (ver Figura 1.6).

1.3.2.3 Acoplamiento de compuestos de semitiofeno que contienen hidroxilo

1) Método del anhídrido succínico: El grupo hidroxilo de los semitiantroides reacciona con el anhídrido succínico en piridina anhidra para obtener anhídrido succínico Hemisuccinato ácido (intermedio con grupos carboxilo) se conjuga luego con el grupo amino de la proteína mediante el método de la carbodiimida o el método del anhídrido mixto, insertando un grupo de ácido succínico entre los hemitiantroides y la proteína portadora (Figura 1.7).

2) Método del carbonildiimidazol : N,N'-carbonildiimidazol es un reactivo altamente activo que introduce grupos carbonilo. Se demostró por primera vez que es un reactivo excelente para formar enlaces amida en la síntesis de péptidos [33]. Las moléculas que contienen grupos hidroxilo reaccionan con carbonildiimidazol para formar el formiato de imidazol intermedio, que reacciona con un N-nucleófilo para formar un enlace formiato N-alquilado, generalmente a través de la cadena lateral de lisina de la proteína y el N de la molécula (. grupo α-amino) y (grupo ε-amino) forman un derivado de uretano sin carga con propiedades químicas extremadamente estables.

1.2.3 Factores que afectan a la calidad del antígeno artificial

La inmunogenicidad del antígeno artificial está relacionada con muchos factores. Para diferentes sustancias, los factores que afectan la inmunogenicidad no son exactamente los mismos y, a menudo, es necesario reajustar el método de síntesis específico del inmunoconjugado después de obtener el anticuerpo. Pero en general, los principales factores que afectan la calidad de los antígenos artificiales son:

1) Relación de acoplamiento

Antes se creía que cuanto mayor era el número de haptenos acoplados a moléculas de proteína, cuanto mayor sea la relación de acoplamiento, mejor. Sin embargo, los experimentos han demostrado que demasiados haptenos no pueden lograr el efecto deseado. Esto se debe a que cuando el portador está cubierto con demasiadas moléculas de hapteno, es posible que no sea propicio para que el portador se una a la superficie de los linfocitos y el portador no puede causar una reacción. respuesta inmune. De hecho, unir una molécula de hapteno a cada molécula portadora es suficiente para producir anticuerpos. Se ha sugerido que, en el caso de BSA, el número de haptenos unidos a la molécula de proteína debería ser de 5 a 20. Rong Kangtai et al. utilizaron diferentes portadores para preparar antígenos artificiales de paraoxon y descubrieron que las tasas de unión óptimas de varios portadores eran diferentes independientemente de si los pesos moleculares eran similares o no. Se recomendó que se determinaran las tasas de unión óptimas de varios portadores. uno por uno para obtener el mejor efecto de inmunidad.

2) Puente de acoplamiento

Algunos investigadores creen que la intervención de una determinada longitud de brazo ayuda a exponer el hapteno y mejorar la especificidad del anticuerpo producido, como Wu Songru et al. [34] encontraron que, en general, cuanto más lejos estaba el grupo de la proteína transportadora, más obvia era la reacción característica. Sin embargo, algunos investigadores han descubierto que la estructura del brazo a menudo tiene un impacto negativo en la detección inmune. A veces, los anticuerpos producidos tienen una afinidad particularmente fuerte por la estructura del brazo, pero tienen una afinidad débil por la pequeña molécula que se va a probar, causando así interferencias en la detección. la detección de anticuerpos específicos. Sionf et al. [35] creen que se pueden adoptar dos métodos para evitar los defectos causados ​​por el puente de acoplamiento: uno es unir la proteína en el mismo sitio del hapteno y el otro es unir la proteína en el mismo sitio. del hapteno, pero no se une a la proteína en el mismo sitio que el hapteno y el antígeno encapsulado. Frieia [36] ha estudiado el inmunoensayo enzimático de pesticidas durante muchos años. Cree que el mejor puente de acoplamiento es una estructura de carbono con 3-6 cadenas lineales.

3) Estructura espacial molecular del hapteno

Es mejor que las moléculas utilizadas como hapteno tengan una estructura ramificada. Es difícil que las moléculas lineales produzcan anticuerpos. Además, algunos antibióticos (antimicrobianos) o pesticidas tienen múltiples sitios de acoplamiento de proteínas, pero según informes de investigación, los antígenos artificiales preparados combinando diferentes sitios con proteínas tienen diferentes títulos y afinidades de anticuerpos, lo que puede deberse a las diferentes estructuras espaciales de los sitios de unión. de haptenos se deben a diferentes motivos. Por ejemplo, al sintetizar antígenos artificiales de trimetoprima y procloraz, los títulos y afinidades de los anticuerpos producidos al combinar diferentes sitios del hapteno con el portador son significativamente diferentes [37, 38].

Por lo tanto, si hay varios sitios de unión diferentes en una molécula, es mejor utilizar todos los sitios diferentes tanto como sea posible para sintetizar antígenos artificiales y luego seleccionar los mejores antígenos artificiales mediante comparación para preparar anticuerpos como prueba.

1.2.4 Evaluación de la calidad del antígeno artificial

1.2.4.1 Determinación de la concentración

El contenido absoluto de antígeno artificial generalmente se expresa mediante la concentración relativa de proteína ( como cuántos miligramos de proteína hay en ml de solución de antígeno). Por lo tanto, la determinación de la concentración de antígeno artificial es consistente con la determinación del contenido relativo de proteína (mg/ml) en la solución de antígeno artificial (esto también refleja que cuanto más puro es el antígeno artificial, más preciso es el valor de concentración). Los métodos comúnmente utilizados incluyen el método de absorción UV, el método de folin-fenol, el método de bis (acetonitrilo), el método micro Kjeldahl, el método de unión de tinte y el método de fluorescencia. No los presentaré uno por uno aquí.

1.2.4.2 Identificación de pureza y análisis de estructura

El método más utilizado para identificar antígenos artificiales de pesticidas es el método de escaneo del espectro ultravioleta si la curva de absorción ultravioleta del antígeno artificial es consistente. con la proteína portadora original y el hapteno Las curvas de escaneo UV son diferentes, lo que puede probar preliminarmente que el antígeno artificial se sintetiza con éxito.

Si el hapteno y la molécula portadora están realmente conectados entre sí después de la reacción y, en caso afirmativo, dónde están sus grupos de conexión. Estos problemas pueden resolverse mediante espectroscopia de absorción infrarroja o espectrometría de masas.

La pureza de la conjugación de antígeno artificial se puede identificar mediante cromatografía de adsorción, cromatografía de partición y electroforesis. El primero tiene un amplio rango de adaptabilidad, pero tiene una baja sensibilidad de identificación. Este último se utiliza para la identificación de la pureza de marcadores enzimáticos de macromoléculas y ciertos conjugados de hapteno. Si solo aparece una banda electroforética en el gráfico de electroforesis, significa que el antígeno artificial ha alcanzado la pureza electroforética. De lo contrario, significa que el antígeno artificial contiene sustancias beneficiosas no acopladas.