Resumen de conocimientos técnicos inmunológicos Capítulo 2

Capítulo 2 Tecnología de preparación de anticuerpos

El concepto básico de anticuerpos: anticuerpos policlonales (anticuerpos secretados por múltiples clones de linfocitos) y anticuerpos monoclonales (anticuerpos secretados por un solo clon de linfocitos B) Anticuerpos secretados )

Características de los anticuerpos monoclonales:

Altamente homogéneos (misma subclase), composición química uniforme, poca o ninguna Ig

Fuerte especificidad, solo se dirige a un determinado epítopo

Fuerte afinidad

Pequeña cantidad de antígeno, sin necesidad de purificación

Sin variación entre lotes

La fuente es estable , se puede producir en lotes y es fácil de estandarizar

No es fácil formar líneas de precipitación

La operación es problemática

¿En qué condiciones se produce? necesario para preparar anticuerpos monoclonales:

La proteína diana tiene una estructura similar

El antígeno es impuro y no se puede separar

El efecto de los anticuerpos policlonales no es bueno (se han descartado reacciones no específicas)

Se espera que los anticuerpos puedan usarse para el tratamiento y convertirse en medicamentos

Se espera que los anticuerpos puedan usarse para el diagnóstico y desarrollarse en reactivos de diagnóstico.

Sección 1? La diferencia entre anticuerpos policlonales

1. Principios de preparación de anticuerpos policlonales

Preparación de anticuerpos, inmunización animal, purificación de anticuerpos

2. Condiciones básicas para los polianticuerpos

1. Preparación de inmunógenos

Los antígenos particulados: células, virus, bacterias, etc., generalmente tienen una fuerte inmunogenicidad, se pueden inyectar directamente por vía intraperitoneal sin agregar auxiliar.

Antígeno soluble: la fuente del antígeno soluble es principalmente la purificación natural, o el gen objetivo se expresa en células procarióticas o eucariotas. El antígeno soluble debe mezclarse total o incompletamente con el adyuvante de Freund.

(1) Extracción de antígeno completo: método de disrupción celular, extracción de antígeno, purificación de antígeno

(2) Reticulación de hapteno y portador: selección de portador, hapteno y acoplamiento de portador método, identificación del complejo de acoplamiento

(3) Antígeno peptídico sintético: selección del péptido inmunogénico, síntesis y purificación del péptido

2. Inmunización de animales Selección:

3. Preparación de adyuvantes:

Tipos de adyuvantes: adyuvantes inorgánicos, adyuvantes orgánicos, adyuvantes sintéticos, aceites

Tres, Métodos básicos para la preparación de anticuerpos policlonales

1. Medición de antígenos, vía de inmunización y calendario de vacunación

Métodos de inmunización de los animales:

El valor del inmunógeno es:

Método de inmunización sin adyuvantes: aplicable a partículas antígenos

Método de inmunización adyuvante de Freund: aplicable a antígenos solubles

Método de inmunización adyuvante de aluminio: aplicable Inmunización en humanos

Inmunización animales (generalmente hembras, dóciles y capaces del parto)

Método de inmunización intradérmica

Método de inmunización subcutánea o intramuscular

Método de inmunización de los ganglios linfáticos

Método mixto

Después de que el título de anticuerpos sea satisfactorio, inyección intravenosa para aumentar la inmunidad

Métodos de inyección comunes: inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección en la vena de la cola, inyección intravenosa

2. Muestra de análisis de sangre. y extracción de sangre

Obtención de antisuero: extracción de sangre orbitaria, sangría de arteria carótida, extracción de sangre cardíaca

Evaluación del efecto inmune: extracción de sangre (arteria de oreja de conejo, vena de cola de ratón), detección ( inmunodifusión bidireccional, ELISA)

3. Tecnología de purificación y aislamiento de anticuerpos

Método de sal, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, separación por electroforesis

Principio de la cromatografía de afinidad: utilizando la unión específica entre proteínas (antígeno-anticuerpo, receptor-ligando (cuerpo) combina un ligando con partículas de gel, captura la sustancia que coincide y eluye otra sustancia, y la elución generalmente utiliza un método de cambio el pH.

Pasos principales: Combinar la proteína con la columna de activación, procesar la ascitis o el suero y pasarlo a través de la columna, lavar la columna con tampón de unión (sepa que A280 es cero), eluir el anticuerpo con tampón Yonganina , cantidades iguales Recoja el eluido, mida el valor de A280 del eluido y retenga las muestras con valores de A280 significativamente elevados.

4. Identificación de anticuerpos

Determinación de la concentración de proteínas: Colorimetría espectrofotométrica UV, método biuret, método Folin fenol,

Evaluación del efecto inmune: Bidireccional inmunodifusión, ELISA

Análisis de pureza: Western blot (WB)

Análisis de categoría de anticuerpos: tiras reactivas Immunogold

Análisis de afinidad: ELISA, polarización de fluorescencia

5. Preservación de anticuerpos

Concentración de anticuerpos: absorción, evaporación, ultrafiltración

Preservación de anticuerpos: concentración + glicerina + conservantes

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Las razones del efecto inmunológico deficiente pueden ser: pureza insuficiente del antígeno, baja inmunogenicidad, emulsificación no calificada de la ruta inmune, dosis inmune inadecuada, enfermedades animales o pequeñas diferencias entre especies.

Sección 2? Tecnología de preparación de anticuerpos monoclonales

1. Principio de preparación de anticuerpos monoclonales

Una célula B solo puede producir un anticuerpo. El método es tecnología de hibridación de ingeniería celular y tecnología de hibridoma de células B.

Es necesario combinar células B monoclonales y células tumorales para producir anticuerpos monoclonales de forma permanente.

Barski et al. fenómeno de fusión natural, pero la frecuencia es muy baja.

Okada et al. descubrieron que la dotación de extinción de incendios de Sendai y el polietilenglicol pueden mejorar significativamente la eficiencia de la fusión celular.

2. Condiciones básicas para la preparación de anticuerpos monoclonales

Es necesario cultivar células B normales y células tumorales de fusión de células B

1. Antígenos inmunes animales y vectores, selección de animales, vía de inmunización

Ejemplo: inmunización en ratones

Primera inmunización: antígeno soluble más adyuvante completo de Freund - inyección subcutánea en el lomo de ratones (4 semanas después)

La segunda inmunización: antígeno soluble más adyuvante incompleto de Freund - inyección subcutánea en la espalda de ratones (3 semanas después)

La tercera inmunización: antígeno soluble más solución salina fisiológica - inyección intraperitoneal en ratones (prueba títulos séricos después de 10 días)

Estimular la inmunidad: antígeno soluble más solución salina fisiológica - inyección intraperitoneal en ratones (después de 3 días)

Fusión celular

2.? Cultivo de células de mieloma deficientes en enzimas

Vía de síntesis del ADN celular:

La hipoxantina (H) sintetiza HGPRT mediante la síntesis de purinas (hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa) y además sintetiza nucleótidos de guanina

<. p> La timidina (T) sintetiza TK (timidina quinasa) a través de la vía de derivación de la síntesis de pirimidina y sintetiza aún más los nucleótidos de timidina.

Los aminoácidos, la glutamina y el monofosfato de guanosina se combinan con los nucleótidos de guanina y los desoxinucleótidos de timina sintetizados anteriormente dos pasos para formar ADN a través de la vía principal de la biosíntesis de ácidos nucleicos.

Si el extremo amino en el tercer paso se cambia a aminopterina (A), no se puede formar ADN.

Por lo tanto, el cribado de células con deficiencia enzimática es el cribado HAT

3. Establecimiento de un método de detección de anticuerpos monoclonales

Tecnología de inmunoenzimas

Inmunización Tecnología de fluorescencia

Tecnología de inmunodifusión

3. Métodos básicos de preparación de anticuerpos monoclonales

1. Cultivo de células de mieloma deficientes en enzimas

Condiciones básicas para el cultivo de tejidos:

Instrumentos: incluida incubadora de CO2, microscopio invertido, mesa ultralimpia, tanque de nitrógeno líquido, centrífuga criogénica de baja velocidad

Reactivos: medio de cultivo, selección HAT Medio de cultivo, medio de cultivo HT, suero, antibióticos

Consumibles: placas de cultivo, cultivos, pipetas, pipetas

Puntos clave para seleccionar líneas celulares de mieloma:

( 1)? ¿Las células de mieloma seleccionadas deben ser las mismas que las de la cepa animal que proporcionó las células inmunes del bazo

(2)? (3)? ¿Sensible a la aminopterina?

(4)?Después de la fusión con las células inmunitarias del bazo, se producen células híbridas de Ig secretadas de forma estable

2. Preparación de las células alimentadoras

Las funciones de las células alimentadoras:

(1) Aumentar la concentración celular para satisfacer los requisitos de densidad celular de las nuevas células de hibridoma.

(2) ¿Fagocitosis de células muertas?

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(3)?Segregar factores estimulantes del crecimiento para promover el crecimiento de células de hibridoma

Tipos y métodos de preparación de células alimentadoras

(1) Macrófagos de la cavidad abdominal del ratón

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(2)? Esplenocitos de ratón

(3) Fibroblastos

3. Aislamiento de células del bazo

(1) Mata al ratón tirando la columna cervical

(2) Retirar el bazo asépticamente

(3) Limpiar y triturar

( 4) Recoger células

( 5) Centrifugar y lavar

(6) Contar las células

4. Fusión celular: células de mieloma y esplenocitos Mezclar según la proporción de 1:10 o 1:5 y añadir el derretido agente PEG

Métodos de fusión celular: fusión de PEG, virus Sendai, electrofusión

5. Cultivo selectivo HAT

Principio del cultivo selectivo HAT: vía principal y compensatoria Vía de biosíntesis del ADN de las células. Cuando existe A, puede bloquear la vía principal de síntesis de ADN y el ADN debe sintetizarse a través de una vía compensatoria. En este caso, HGPRT necesita usar H para sintetizar ADN, o TK usa T para sintetizar ADN.

Debido a la selección de células de mieloma deficientes en xantina guanina transferasa (HPRR-) o células deficientes en quinasa de escisión de timidina (TK-) como padres, la escuela solo puede utilizar medios de cultivo de ADN grupales totalmente condicionados. se pueden sintetizar, por lo que las células híbridas obtienen genes HGPPT o TK mediante complementación. Sólo las células híbridas pueden sobrevivir, las células con deficiencia de enzimas no pueden sobrevivir en absoluto y las células B monoclonales generalmente no pueden crecer durante mucho tiempo, por lo que desempeña la función de aislar las células híbridas.

? Crecimiento celular: 3-4 días después de la fusión, se pueden ver células de mieloma y clones claros. El sobrenadante del cultivo se eliminó los días 7-9 después de la fusión para detectar anticuerpos específicos.

? Las células que sobreviven después del cribado son células de fusión de células del bazo y células de mieloma.

6. ?Cribado de clones positivos

Método de detección de células de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales

Tecnología de inmunoenzimas: introducción al método ELISA

Tecnología de inmunofluorescencia: ensayo de inmunofluorescencia indirecta, tecnología de análisis de citometría de flujo (control negativo: sobrenadante de cultivo de células de mieloma, control positivo: suero inmune de ratón)

7. ?Cultivo clonal: monoclonalización positiva de células

La clonación se refiere al proceso de multiplicar y amplificar una sola célula para formar una colonia de células con características uniformes.

Los métodos comunes incluyen: método de dilución limitante y tecnología de clonación en agar blando

Método de dilución limitante: recolecte células de hibridoma de pocillos de secreción positiva.

Tecnología de clonación en agar blando: recolecte células de hibridoma de los pocillos de secreción positivos y agregue una concentración adecuada de células de hibridoma al medio de agar blando para formar un grupo de células con proliferación celular.

Identificación de anticuerpos monoclonales:

(1)? Prueba de sensibilidad de anticuerpos: determinación de título de líquido ascítico y sobrenadante de cultivo

(2) ? : si interactúa con otros antígenos.

(3) Determinación del título de anticuerpos

(4)? Identificación de subclases de anticuerpos: IgG (IgG1, IgG2, IgG3), IgM

(5) ? Identificación de afinidad de anticuerpos

(6)? Análisis de reconocimiento de epítopos

8. Producción ampliada de anticuerpos monoclonales: método de cultivo celular, método de inducción in vivo en ratón, biorreactor

Método de cultivo celular: células de hibridoma, cultivo en frascos o tanques de cultivo, recolección de sobrenadantes, purificación de anticuerpos

Método de inducción animal: ratones Balb/c, inyección intraperitoneal de 0,5 ml de líquido laminar o fitano, inoculación intraperitoneal de hibridoma células, recolección de líquido ascítico

Biorreactor: cultivo en fermentador

Preguntas frecuentes sobre el cultivo de anticuerpos monoclonales:

(1) ¿Contaminación: entorno de cultivo, funcionamiento

(2)? Las células de fusión no crecen: PEG, suero, medio de cultivo HAT

(3) ¿Secreción insuficiente de anticuerpos: contaminación por micoplasma, mutación celular, problemas con el sistema de cultivo? /p>

(4)? Dificultad para clonar células de hibridoma: calidad del suero, actividad celular

Sección 3 Tecnología de preparación de anticuerpos genéticamente modificados

Anticuerpos genéticamente modificados: ¿una tecnología que utiliza? Ingeniería genética para modificar artificialmente células según los deseos personales.

Las principales ventajas son: alta especificidad, calidad estable, bajo costo, proceso simple, baja caída heterogénea, buena penetración y funciones ricas.

1. Humanización de anticuerpos de ratón

Obstáculos en la aplicación de anticuerpos de ratón: inmunogenicidad, vida media corta e inactivación de fragmentos funcionales de anticuerpos.

1. ?Anticuerpos quiméricos: clonación de genes de región variable, construcción de vectores de expresión, expresión de anticuerpos quiméricos

2. ?Anticuerpos modificados

2. Molécula pequeña anticuerpos: anticuerpos Fab, anticuerpos Fv, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, unidades de reconocimiento mínimas

Ventajas de los anticuerpos de molécula pequeña:

(1) Se pueden utilizar en sistemas procarióticos de expresión media y reducir los costos de producción.

(2) Debido a su pequeño peso molecular y su gran capacidad de penetración, puede ingresar fácilmente al sitio de la lesión y es beneficioso para el tratamiento de tumores y otras enfermedades.

(3) No contiene fragmentos Fc y no se une a los receptores Fc, lo que puede reducir los efectos adversos causados ​​por los receptores Fc ampliamente distribuidos.

(4) Tiene una vida media corta en el cuerpo, lo que favorece la eliminación de sustancias tóxicas en el cuerpo.

(5) Es fácil ser más genético diseñado.

3.] Aplicaciones basadas en anticuerpos

1. ?Inmunoterapia CAR-T:

?Inmunoterapia CAR-T: la inmunoterapia de células T con receptor de antígeno quimérico es una nuevo tipo de terapia celular adoptiva, que utiliza las propias células inmunes del paciente para eliminar las células cancerosas. No es un medicamento.

? Tecnología CAR-T: Una terapia que utiliza células T genéticamente modificadas para resistir a las células tumorales a través de todo el receptor de antígeno quimérico. Los receptores de antígenos quiméricos pueden reconocer específicamente antígenos relacionados con tumores o antígenos específicos de tumores. Después del reconocimiento y la unión, transmitirán señales de activación y valor agregado a las células T, lo que hará que las células T se activen, proliferen y liberen citoquinas, matando así las células tumorales.

2.Puntos de control inmunológico

3.?Inmunotoxinas

4.?ADCs

5.?Anticuerpos biespecíficos

Sección 4?[endif]Tecnología de biblioteca de anticuerpos

Tecnología de biblioteca de anticuerpos: uso de tecnología de clonación de genes para clonar todo el conjunto de genes de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos y recombinarlos en vectores de expresión procarióticos, expresar directamente fragmentos de moléculas de anticuerpos funcionales a través del sistema procariótico y seleccionan moléculas de anticuerpos específicas y genes de regiones variables.

1. Principio de la tecnología de presentación en fagos: la tecnología de presentación en fagos consiste en buscar la proteína extraña o la secuencia de ADN en la posición adecuada en la cubierta del fago, de modo que el gen extraño pueda expresarse junto con la expresión del Al mismo tiempo, el gen extraño La proteína fuente se muestra a medida que se vuelve a ensamblar el fago, que es una biotecnología en la superficie de la célula bacteriana. Hasta ahora, la gente ha desarrollado sistemas de presentación de fagos filamentosos monocatenarios, sistemas de presentación de fagos T4, sistemas de presentación de fagos lambda, etc.

2. Procedimientos básicos para la preparación de anticuerpos en fagos

1. Recoger linfocitos para extraer ARNm y transcribirlo a ADNc o extraer directamente ADN del genoma de Sberg

2. ?Amplificar los genes de la región variable del anticuerpo del ADN

3. [Construir una biblioteca de fagos recombinantes

4. ?Buscar fagos recombinantes con las características requeridas

5 ?Utilice mutación o reemplazo de cadena para madurar la afinidad

3. Características de la tecnología de anticuerpos fagos

1. ?Los pasos de detección son simples, rápidos y efectivos

2. ?El flujo de detección se ha ampliado y se pueden detectar más de 1010 clones a la vez

3. ?El genotipo del anticuerpo está estrechamente relacionado con el rendimiento y el gen es estable y fácil de modificar

4. Simulación del proceso de maduración de la afinidad del sistema inmunológico natural

5. ?No necesita vacunación artificial

6. ?Reemplazable por anticuerpos policlonales animales

7. ?Construyendo un cuerpo sano. Los genes de la región variable de las cadenas ligera y pesada se combinan aleatoriamente in vitro, lo que puede producir la combinación de cadenas ligeras y pesadas existentes en el cuerpo y obtener nuevos anticuerpos específicos.

8. ?Puede expresarse en planos y sistemas, convenientes para la producción en masa y de bajo costo.

4. Aplicación de la tecnología de bibliotecas de anticuerpos

1. Preparación de anticuerpos totalmente humanos

2. Anticuerpos mejorados genéticamente modificados