¿Qué métodos y equipos se utilizan generalmente para la detección experimental de Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus y Pasteurella? Explique en detalle.
Escherichia coli
Tomar 10ml de la solución problema (equivalente a 1g, 1ml, 10cm2 del producto problema), e inocularlo directamente o después del tratamiento en una cantidad adecuada (no menos En 100ml) de medio de cultivo lactosa, sales biliares, cultivo durante 18 a 24 horas, que puede ampliarse a 48 horas si es necesario.
Tomar 0,2 ml del cultivo anterior, inocularlo en un tubo de ensayo que contenga 5 ml de medio de cultivo MUG, cultivarlo, observarlo bajo luz ultravioleta de 366 nm durante 5 horas y 24 horas, y utilizar medio de cultivo MUG sin inocular. como control de fondo. Si el cultivo en el tubo muestra fluorescencia, es MUG positivo; si no muestra fluorescencia, es MUG negativo. Después de la observación, agregue unas gotas de solución de prueba de matriz de índigo a lo largo de la pared del tubo de cultivo. Si la superficie del líquido se vuelve rosa roja, es positiva para la matriz de índigo; si muestra el color verdadero del reactivo, es negativa para la matriz de índigo. Los controles de fondo deben ser negativos para MUG y negativos para matriz índigo.
Si la MUG es positiva y la matriz de índigo es positiva, se considera que el producto de prueba ha detectado Escherichia coli; si la MUG es negativa y la matriz de índigo es negativa, el producto de prueba; se considera que no ha detectado Escherichia coli si la MUG es positiva, si la matriz de índigo es negativa, o la MUG es negativa y la matriz de índigo es positiva, el cultivo de medio de lactosa de sales biliares debe sembrarse e inocularse en el placa de medio agar eosina azul de metileno o medio agar MacConkey y se cultiva durante 18 a 24 horas.
Si no crecen colonias en la placa, o las colonias cultivadas no coinciden con las características morfológicas de las colonias enumeradas en la Tabla 1, se determina que Escherichia coli no se detecta en el producto de prueba. Si las colonias que crecen en la placa son consistentes o sospechosas de las características morfológicas de las colonias enumeradas en la Tabla 1, se deben realizar aislamiento, purificación, microscopía de tinción y pruebas bioquímicas apropiadas para confirmar si son Escherichia coli.
Tabla 1 Características morfológicas de las colonias de Escherichia coli
Morfología de las colonias medias
El agar eosina azul de metileno aparece azul-negro, violeta claro, azul-violeta o rosa, el el centro de la colonia es de color púrpura oscuro o sin centro oscuro obvio, bordes redondos, ligeramente elevados y prolijos, superficie lisa y húmeda, a menudo con brillo metálico
Agar MacConkey, rosa brillante o rojizo, el centro de la colonia es de color rosa oscuro, redondo, plano, con bordes prolijos, superficie lisa y húmeda
Salmonella (Salmonella)
Tomar 10g o 10ml de la muestra problema, directamente o después del tratamiento Inocular en un cantidad adecuada (no menos de 200 ml) de medio de cultivo caldo nutritivo, mezclar con un homogeneizador u otros métodos adecuados y cultivar durante 18 a 24 horas.
Tomar 1 ml del cultivo anterior e inocularlo en 10 ml de medio verde brillante de tetratiosulfato de sodio. Después de cultivar durante 18 a 24 horas, inocular en agar de leche con azufre bilis (o agar Salmonella o Shigella). medio y placa de medio con agar MacConkey (o agar eosina azul de metileno), cultivo durante 18 a 24 horas (ampliar de 40 a 48 horas si es necesario). Si no crecen colonias en la placa, o las colonias que crecen tienen características diferentes a las enumeradas en la Tabla 4, se determina que no se detecta Salmonella en el producto de prueba.
Si las colonias que crecen en la placa son consistentes o sospechosas de las características morfológicas de las colonias enumeradas en la Tabla 4, use una aguja de inoculación para seleccionar 2 a 3 colonias e inocularlas en la pendiente de gran altura. de medio agar triple azúcar hierro. Punción de inoculación y cultivo durante 18 a 24 horas. Si no se ve rojo en la capa inclinada ni amarillo en la capa inferior, o si la inclinación es amarilla y no hay negro en la capa inferior; Se considera que no se detecta Salmonella en el producto de prueba. De lo contrario, el cultivo en medio inclinado de agar hierro triple azúcar debe someterse a pruebas bioquímicas apropiadas y prueba de aglutinación de suero para confirmar si se trata de Salmonella.
Tabla 4 Características morfológicas de las colonias de Salmonella
Morfología de colonias media
Agar leche con sales biliares y azufre de incoloro a naranja claro, translúcido, con el centro negro en la colonia O todo negro o nada negro
El agar Salmonella y Shigella es de incoloro a rojo claro, translúcido u opaco, y el centro de la colonia a veces es de color marrón oscuro
Agar eosina azul de metileno De incoloro a claro colonias redondas de color naranja, transparentes o translúcidas, lisas y húmedas
Agar MacConkey De incoloro a naranja claro, transparente o translúcido, el centro de la colonia a veces es oscuro.
Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus)
Tomar 10ml de la solución problema (equivalente a 1g, 1ml, 10cm2 del producto problema), e inocularlo directamente o después del tratamiento en una zona adecuada. cantidad (no menos En 100 ml) de medio de cultivo de caldo de sulfito de sodio (potasio) (o caldo nutritivo), cultivo durante 18 a 24 horas, que puede ampliarse a 48 horas si es necesario. Tome el cultivo mencionado anteriormente e inocúlelo en la placa de medio de agar con cloruro de sodio y yema de huevo o medio de agar con cloruro de sodio y manitol y cultívelo durante 24 a 72 horas. Si no crecen colonias en la placa o las colonias cultivadas son diferentes de las características enumeradas en la Tabla 5, se considera que no se detecta Staphylococcus aureus en la muestra de prueba.
Tabla 5 Características morfológicas de las colonias de Staphylococcus aureus
Morfología de colonias medianas
Agar manitol óxido sódico Amarillo dorado, redondo y convexo, bordes limpios, hay un color amarillo anillo en la periferia y el diámetro de la colonia es de 0,7 ~ 1 mm
El agar de cloruro de sodio y yema de huevo es de color amarillo dorado, redondo y convexo, con bordes limpios, y hay un anillo opacificante con lecitina descompuesta en el periferia y el diámetro de la colonia es de 1~2 mm
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Si las colonias que crecen en la placa son consistentes o sospechosas de las características de las colonias enumeradas en la Tabla 5, 2 a 3 Se deben seleccionar colonias, inocularlas en la inclinación del medio de agar nutritivo y cultivarlas durante 18 a 24 horas. Tome el cultivo del medio de agar nutritivo para la tinción de Gram, inocúlelo en el medio de caldo nutritivo y cultívelo durante 18 a 24 horas como prueba de coagulasa plasmática.
Prueba de coagulasa de plasma: Tome 3 tubos de ensayo pequeños estériles, agregue 0,5 ml de plasma y una mezcla de agua esterilizada (1:1) a cada uno, y luego agregue caldo nutritivo de cultivo de cepas coagulables (o suspensión bacteriana concentrada preparada de cultivo inclinado en medio de agar nutritivo) 0,5 ml, cultivo en caldo nutritivo de Staphylococcus aureus (o suspensión bacteriana concentrada preparada a partir de cultivo inclinado en medio de agar nutritivo) 0,5 ml, caldo nutritivo O 0,5 ml de solución estéril de cloruro de sodio al 0,9%, que es el tubo de ensayo, tubo de control positivo y tubo de control negativo. Los tres tubos se cultivaron al mismo tiempo y la observación comenzó después de 3 horas hasta las 24 horas. El plasma en el tubo de control negativo debe fluir libremente y el plasma en el tubo de control positivo debe coagularse. Si el plasma en el tubo de ensayo está coagulado, la prueba de coagulasa plasmática es positiva; de lo contrario, es negativa. Si el tubo de control positivo o el tubo de control negativo no cumplen con los requisitos, se debe preparar otro plasma y repetir la prueba.
Si las bacterias sospechosas anteriores son cocos no grampositivos y la prueba de coagulasa plasmática es negativa, se considera que no se detecta Staphylococcus aureus en la muestra de prueba.