Aplicaciones específicas de la hibridación fluorescente in situ
La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una tecnología citogenética molecular no radiactiva desarrollada a finales de los años 80 sobre la base de la hibridación in situ radiactiva. Utiliza etiquetas fluorescentes en lugar de etiquetas isotópicas. método. La sonda primero se conjuga con una molécula indicadora y luego se une a un tinte fluorescente mediante un proceso inmunocitoquímico. El principio básico de FISH es marcar sondas de ADN (o ARN) con moléculas de nucleótidos especiales y luego hibridar las sondas directamente con cromosomas o secciones de fibras de ADN. Los anticuerpos monoclonales acoplados a moléculas de fluoresceína se unen específicamente a moléculas sonda para realizar análisis cualitativos, de localización y cuantitativos relativos de secuencias de ADN en cromosomas o secciones de fibras de ADN. La tecnología FISH tiene las ventajas de seguridad, velocidad, alta sensibilidad, almacenamiento a largo plazo de sondas y visualización multicolor de núcleos celulares en metafase e interfase. Al mismo tiempo, se desarrollaron la hibridación in situ de fluorescencia multicolor y la hibridación in situ de fluorescencia de fibras de cromatina basadas en la hibridación in situ de fluorescencia.
Para la hibridación fluorescente in situ utilizando ARNr, las siguientes razones pueden conducir a una menor intensidad de la señal de fluorescencia:
Menor contenido de ribosomas celulares
Células periféricas Baja permeabilidad
Baja accesibilidad de la secuencia objetivo (debido a la conformación producida por el plegamiento del ARNr, algunas posiciones en la molécula de ARNr están en estrecho contacto con otras cadenas u otros ARNr o proteínas, lo que hace que la sonda no pueda hibridarse con la secuencia objetivo ).
Para probar si la secuencia diana en la célula se hibrida fácilmente con la sonda y probar la temperatura de hibridación óptima, se pueden realizar experimentos mediante "cloning-FISH": integrar el gen rRNA en un plásmido y transformarlo en E. coli. Se expresa y luego se hibrida con sondas marcadas con fluorescencia.
FISH se puede combinar con citometría de flujo para contar o aislar células específicas marcadas con fluorescencia.
Introducción a la tecnología de hibridación in situ fluorescente
En 1974, Evans combinó por primera vez la tecnología de bandas cromosómicas con la hibridación cromosómica in situ para mejorar la precisión del posicionamiento. A fines de la década de 1970, la gente comenzó a explorar el uso de marcadores fluorescentes para la hibridación in situ, es decir, la tecnología FISH. En 1981, Harper localizó con éxito una única copia de la secuencia de ADN en muestras con bandas G, lo que marcó un avance importante en la tecnología de mapeo cromosómico. En la década de 1990, con el progreso del Proyecto Genoma Humano y la necesidad de dibujar mapas del genoma humano de alta resolución, la tecnología FISH se desarrolló rápidamente y se utilizó ampliamente.
1. Principios
La tecnología de hibridación in situ por fluorescencia es una importante tecnología de hibridación in situ no radiactiva. El principio básico es que si el ADN diana en el cromosoma o fragmento de fibra de ADN detectado es homólogo y complementario a la sonda de ácido nucleico utilizada, se puede formar un híbrido entre el ADN diana y la sonda de ácido nucleico después de la desnaturalización-hibridación-renaturalización. Cuando un determinado nucleótido de una sonda de ácido nucleico se marca con una molécula indicadora como biotina y digoxigenina, se puede lograr una identificación cualitativa bajo un microscopio utilizando la reacción inmunoquímica entre la molécula indicadora y la avidina específica marcada con fluoresceína, cuantificándola o posicionándola relativamente. el ADN a detectar.
2. Proceso experimental
Preparación de muestras de pescado → Preparación de sondas → Etiquetado de sondas → Hibridación → (bandas cromosómicas) → Detección por microscopía de fluorescencia → Análisis de resultados.
3. Características
Según el tipo de molécula marcadora, las sondas de hibridación in situ se pueden dividir en marcadores radiactivos y marcadores no radiactivos. La ventaja de las sondas radiactivas marcadas con isótopos es que requieren menos preparación de la muestra, pueden mejorar la intensidad de la señal al extender el tiempo de exposición y, por lo tanto, son más sensibles. Las desventajas son que la sonda es inestable, el tiempo de autorradiografía es largo, la resolución espacial es baja debido a la dispersión de la radiación y la operación de los isótopos es compleja. Estas deficiencias se pueden superar utilizando un sistema de etiquetado fluorescente, que es la tecnología FISH. Como sistema de detección no radiactivo, la tecnología FISH tiene las siguientes ventajas: 1. Los reactivos y sondas fluorescentes son económicos y seguros 2. La sonda es estable y se puede utilizar dentro de los dos años posteriores a un etiquetado 3. El ciclo experimental es corto; y los resultados se pueden obtener de forma rápida y específica. Buen rendimiento y posicionamiento preciso. 4. FISH puede localizar secuencias de ADN de hasta 1 kb de longitud, con sensibilidad comparable a las sondas radiactivas. 5. FISH multicolor puede detectar múltiples secuencias al mismo tiempo; mostrando diferentes colores en el mismo núcleo; 6. Cromosomas en metafase Los cambios en número o estructura se pueden mostrar en un portaobjetos de vidrio, y la estructura del ADN cromosómico en interfase también se puede mostrar en suspensión.
Desventajas: No se puede lograr una hibridación del 100%, especialmente cuando se utilizan sondas de ADNc cortas, la eficiencia se reduce significativamente.
4. Aplicación
Esta tecnología se puede utilizar no sólo para la localización cromosómica de genes o secuencias conocidas, sino también para la clonación de genes o marcadores genéticos y el estudio de aberraciones cromosómicas. Tiene ventajas en la investigación sobre caracterización, cuantificación, integración y expresión de genes.
En esta sección, edite el historial de desarrollo de la hibridación fluorescente in situ.
1 Número de sitios web de pruebas de tecnología FISH y objetivos de pruebas de desarrollo.
Después del establecimiento básico de la tecnología FISH, la tecnología FISH no solo se utiliza para la detección de genes individuales o ácidos nucleicos, sino que también se extiende a la detección simultánea de múltiples sitios genéticos en peces multicolores, desde genes detección de genoma, cromosoma y detección in situ de transcripciones en células vivas y detección de ácido nucleico a nivel de tejido, y aplicación de ARNm para la detección de organismos completos en futuras investigaciones. Las primeras sondas eran grandes y se obtuvieron clones híbridos específicos mediante propagación de vectores, traducción de mellas, transcripción in vitro y síntesis de ADN con cebadores aleatorios. Sin embargo, los fragmentos grandes de sondas suelen tener secuencias repetitivas, lo que da como resultado un fondo de alta fluorescencia. Los métodos de pretratamiento que utilizan ácidos nucleicos no marcados para unirse a sitios no específicos para suprimir la hibridación no específica pueden superar los problemas anteriores, y los investigadores pueden ampliar el objetivo de detección y lograr la tinción de todo el cromosoma. En citogenética, la tecnología FISH ha mejorado significativamente en el análisis de cromosomas. Por ejemplo, la hibridación genómica comparativa se utiliza para detectar deleciones y duplicaciones de regiones cromosómicas. Una vez que la sonda del fragmento grande se une de manera no específica a la muestra, formará una señal que confunde la detección de genes en el cromosoma y debe cortarse en pequeños fragmentos de <200 nucleótidos. Hoy en día, la mejora de los métodos de detección y el desarrollo continuo del software de detección han hecho que los requisitos de detección de la tecnología FISH sean cada vez menores y la sensibilidad sea cada vez mayor. La mejora continua de los algoritmos precisos de procesamiento de imágenes por computadora ha dado como resultado una tecnología de alta resolución para sondas a nivel submicroscópico. A medida que los objetivos de detección se vuelven cada vez más pequeños, la tecnología FISH se ha utilizado para reordenamientos ocultos de genes cariotípicos subteloméricos, mapeo cromosómico preciso y detección de ARNm de copia única.
Con la expansión del alcance de la detección de FISH, la aplicación de la tecnología FISH aumentó rápidamente en la década de 1990. La rama tecnológica formada mediante la aplicación de la tecnología FISH ha logrado la detección simultánea de cada vez más tipos diferentes de loci. En primer lugar, se utilizan diferentes fluoróforos para detectar múltiples sitios, como la fluorescencia de dos colores para detectar secuencias de ácidos nucleicos específicas, y cada cromosoma, gen o transcrito está representado por una señal fluorescente distinguible. Posteriormente se adoptaron dos esquemas de codificación de colores, ampliando aún más la gama de aplicaciones de FISH. El esquema de decodificación describe principalmente sitios múltiples en términos de proporción de color, es decir, la proporción de cada color en el color total. Cada uno de los métodos anteriores, o una combinación de ambos métodos, detectó hasta 12 sitios. El esquema de cinco colores traducido por computadora puede detectar todos los cromosomas humanos simultáneamente y representa un hito en la detección multilocus de la tecnología de peces. Aunque los ARNm pueden visualizarse mediante muchos métodos, el análisis in situ de transcripciones completas mediante FISH parece ser más prometedor. La tecnología de codificación por colores permite la inspección de todo el tejido.
2 La tecnología FISH en la etapa de análisis cuantitativo
Pinkel et al. (1986) utilizaron por primera vez el análisis cuantitativo de imágenes de fluorescencia para pruebas citogenéticas básicas y utilizaron una cámara con un dispositivo de bloqueo de excitación de doble color. Para detectar señales de fluorescencia, la tecnología de análisis cuantitativo se utilizó rápidamente para la detección de ARNm. La clave para la detección de fluorescencia es la reproducibilidad e irregularidad de la señal y la autofluorescencia del fondo. No sólo diferentes muestras tienen diferente fluorescencia, sino que los materiales en el mismo portaobjetos o en la misma célula también pueden tener una fluorescencia desigual. Actualmente, existen muchos métodos para eliminar la autofluorescencia en ciertos tejidos: por ejemplo, durante el proceso de preparación de la muestra, se usa borohidruro de sodio como reactivo para eliminar la autofluorescencia, o se usa un pretratamiento con radiación luminosa para eliminar señales de fondo no específicas. Estos métodos para eliminar la autofluorescencia no son completamente efectivos y las señales de autofluorescencia a menudo se eliminan mediante operaciones informáticas en el análisis de imágenes. Los datos espectrales de las imágenes de fluorescencia incluyen señales reales y mucho ruido, que se analizan por separado y se eliminan mediante un análisis de componentes espectrales individuales. Multicolor FISH tiene sus propias limitaciones, incluidas las diferentes intensidades de fluorescencia y la superposición de colores. Pero las imágenes multicolores se equilibran mediante análisis de algoritmos informáticos, incluida la corrección automática de cambios de intensidad y superposición de señales.
Las limitaciones de las imágenes de peces en sí no afectaron al desarrollo de algoritmos de decodificación automática. La detección del sitio de ADN mediante sondas de secuencia grande y los algoritmos de conteo de fluorescencia multicolor ayudan a los patólogos a lograr análisis automatizados.
Además, la aplicación de kits de sondas de detección y métodos de conteo de puntos proporciona una plataforma para obtener resultados de detección convenientes. Aunque se han utilizado muchos métodos para analizar u optimizar los sistemas automatizados de detección de células, la detección manual de citopatología sigue siendo un método de análisis de tejidos muy fiable. Sin embargo, en el diagnóstico médico futuro, no se puede ignorar la alta eficiencia de la preparación celular, la identificación y la detección computarizada de muestras celulares en medios fijos, y la detección rápida de señales moleculares intracelulares solo puede detectarse mediante métodos asistidos por computadora. Los procedimientos de detección automatizados ahora se han ampliado para utilizar modelos de transcripción multigénica para detectar grupos de ADN y sitios de transcripción específicos para determinar el estado de las células funcionales.
3 El desarrollo de la tecnología FISH en el campo de la detección
Dado que el desarrollo inicial de FISH se centró principalmente en la expansión de tipos de sondas y sitios de detección, el desarrollo futuro de la tecnología de detección de fluorescencia puede incluir ampliación en el campo de detección. La aplicación de diagnóstico clínico de imágenes de fluorescencia requiere mejoras adicionales en el sistema de detección, como la combinación de sondas, la automatización de la fotografía y el análisis, para evitar errores entre diferentes operaciones. El espesor de la muestra es un factor limitante en los tipos de muestras examinadas con microscopía de fluorescencia. Las técnicas recientes de microscopía confocal láser y tomografía óptica de rayos X requieren espesores de muestra de 1 a 2 mm. Una técnica mejorada de microtomografía de rayos X de proyección óptica puede obtener imágenes de muestras con un espesor de 65.438 ± 0,5 mm, ampliando el rango de detección de muestras biológicas y de diagnóstico. También se ha informado de la detección de células vivas mediante la tecnología FISH de ARN. Para la detección se pueden utilizar tanto los fluoróforos liberados in vivo como la fluoresceína de las sondas de hibridación. Estos dos nuevos métodos pueden reducir el fondo alto en presencia de sondas marcadas no específicas (como en células vivas) y pueden usarse para rastrear la síntesis y transferencia de ARNm. Estos métodos detectan diferentes moléculas diana más fácilmente que la proteína verde fluorescente (GFP). En comparación con la detección por hibridación in situ de células vivas GFP, FISH es susceptible a sondas sintéticas intracelulares. Es necesario mejorar aún más FISH para reducir el fondo de interferencia en la detección de expresión génica in vivo y evitar la interferencia de la autohibridación intracelular. De hecho, no es necesario considerar la diferencia entre la detección de FISH y la tecnología de detección de proteínas fluorescentes. La combinación de la tecnología de FISH y la tecnología de proteínas fluorescentes puede detectar ácidos nucleicos y proteínas diana al mismo tiempo.
La aplicación de la tecnología de microscopía multifotónica ha ampliado aún más el ámbito de aplicación de las imágenes de fluorescencia. Con la microscopía multifotónica, un bloque láser puede emitir fotones y enfocarlos en el microscopio para excitar el fluoróforo objetivo dos o tres veces. La luz de excitación del infrarrojo cercano puede penetrar más profundamente en las muestras biológicas y es menos tóxica para las muestras vivas que la luz visible. Las aplicaciones de este nuevo enfoque ya están aplicando imágenes de fluorescencia a la detección de sistemas vivos e incluso de cuerpos animales completos. Debido a la incapacidad de sintetizar sondas de biomarcadores, las aplicaciones in vivo de imágenes de fluorescencia se limitan a la detección de moléculas fluorescentes o la autofluorescencia de organismos. Las señales de autofluorescencia producidas por tejidos biológicos durante procesos fisiológicos o fisiopatológicos normales se pueden utilizar como señales de diagnóstico importantes. Una vez que las sondas biológicas sean posibles, se convertirán en un poderoso medio auxiliar para identificar secuencias de ácidos nucleicos específicas, realizar diagnósticos no invasivos y obtener imágenes de diagnóstico.