Clasificación de la electroforesis de ácidos nucleicos.
Cuando el gel se coloca en un campo eléctrico, los ácidos nucleicos cargados migran a través de la rejilla del gel hasta el ánodo a pH neutro. La velocidad de migración se ve afectada por el tamaño molecular, la conformación, la concentración de agarosa, el voltaje aplicado. Efectos del campo eléctrico, tampón de electroforesis y cantidad de tinte incrustado. Después de la electroforesis en diferentes condiciones durante un tiempo apropiado, los fragmentos de ácido nucleico de diferentes tamaños y conformaciones estarán en diferentes posiciones en el gel, logrando así el propósito de la separación. El gel de agarosa tiene un amplio rango de separación y los geles de agarosa de diversas concentraciones pueden separar ADN de 200 BP a 50 kb de longitud.
2. Los instrumentos y reactivos para la electroforesis en gel de agarosa deben incluir un tanque de electroforesis en gel horizontal y su peine de electroforesis de soporte, un instrumento de electroforesis de voltaje estabilizado, un horno microondas o un horno eléctrico común. También está equipado con un detector UV y un sistema de cámara.
Los reactivos incluyen agarosa, tampón de electroforesis, solución de bromuro de etidio y tampón de carga de gel.
El tampón de electroforesis suele ser TBE (1.000 ml contienen 5,4 g de Tris, 2,75 g de ácido bórico, 2 ml de EDTA de 0,5 mol/l, pH 8,0).
El bromuro de etidio (EB) es un tinte fluorescente que puede incrustarse entre pares de bases en ácidos nucleicos bicatenarios y migrar con los fragmentos de ácido nucleico durante la electroforesis. Cuando el gel se coloca bajo luz ultravioleta, el EB insertado en la cadena de ácido nucleico genera fluorescencia roja bajo la excitación de la luz ultravioleta, que puede mostrar claramente la migración de cada fragmento de ácido nucleico. El EB se descompone fácilmente con la luz y debe almacenarse en una botella de reactivo marrón a 4°C. Dado que la EB es un mutágeno fuerte con toxicidad moderada, debe manipularse con guantes.
Hay cuatro tampones de carga de gel de uso común, como se muestra en la siguiente tabla: Tampón de carga de gel tipo de tampón 6 × fórmula de tampón temperatura de almacenamiento ⅰ 0,25 % de azul de bromofenol.
Azul de xileno al 0,25%
Solución acuosa de sacarosa al 40% (p/v) 4 ℃ⅱAzul de bromofenol al 0,25%
Azul de xileno al 0,25%
Solución acuosa de sacarosa al 15 % (p/v) a temperatura ambiente ⅲ 0,25 % de azul de bromofenol
0,25 % de azul de xileno
4 ℃ 30 % (p/v) de glicerol solución ⅳ 4°C 40% (P/V) solución de sacarosa 3. Preparación de geles y electroforesis.
El método de operación es el siguiente:
(1) Use pegamento transparente para sellar el borde de la placa de vidrio o placa de plástico equipada con el dispositivo de electroforesis, haga un molde de pegamento y colóquelo en un banco de trabajo horizontal;
(2) Pese una cantidad adecuada de agarosa, colóquela en el tampón de electroforesis y caliente para disolver la agarosa;
(3) Cuando el la solución se enfría a 60 °C, agregue 10 mg/ml de solución de almacenamiento de EB para que la concentración final alcance 0,5 mg/ml;
(4) Coloque el peine de electroforesis a 0,5-1 mm de distancia de la placa inferior del molde de plástico, vierta la solución de agarosa en el molde de plástico, el espesor es de aproximadamente 3-5 mm, tenga cuidado de evitar burbujas de aire;
(5) Después de que el gel esté completamente solidificado, retire el peine y el pegamento transparente Y coloque el gel en el tanque de electroforesis. Agregue el tampón TBE de modo que pase aproximadamente 1 mm a través de la superficie adhesiva;
(6) Mezcle la muestra de ADN con 1/6 del volumen del tampón de carga y agréguelo al tanque de muestra;
(7) Encienda la alimentación, coloque el tanque de muestra en el extremo negativo y use un voltaje de 1-5v/cm para la electroforesis durante un tiempo adecuado.
(8) Después de la electroforesis, el gel; que contiene EB se puede colocar directamente en Observar en el detector UV y tomar fotografías para registrar, o teñir el gel sin EB en una solución de EB de 0,5 μg/ml durante 30 a 45 minutos, luego observar y tomar fotografías de acuerdo con el método anterior y registrar los resultados.
4. Fotografía en gel
Requiere una cámara de 135, una película de 135 a todo color, un soporte para la cámara, una lente para primeros planos y un filtro rojo, y una máscara protectora de plexiglás.
La cirugía debe realizarse en una habitación oscura. Fija la cámara, coloca el gel en una posición adecuada sobre el detector UV, enfoca, instala el filtro rojo y toma fotografías como de costumbre.
También se puede utilizar un sistema automático de procesamiento de gel, pero el coste del instrumento es elevado.
5. Purificación 5. Solución de EB
Dado que la EB tiene cierta toxicidad, después del experimento, la solución que contiene EB debe purificarse antes de desecharse para evitar contaminar el medio ambiente y poner en peligro la salud humana.
(1) Las soluciones con contenido de EB superior a 0,5 μg/ml se pueden procesar de la siguiente manera:
(1) Diluir la solución de EB con agua hasta una concentración inferior a 0,5 μg/ml. ml;
(2) Añadir 1 volumen de 0,5 mol/L de KMnO4, mezclar bien, añadir un volumen igual de 25 mol/L de HCl, mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante varias horas;
③Agregue 1 vez el volumen de 2,5 mol/L de NaOH, mezcle bien y deseche.
(2) Las soluciones con un contenido de EB inferior a 0,5 μg/ml se pueden procesar de la siguiente manera:
(1) Agregue carbón activado en una cantidad de 1 mg/ml y agite suavemente. de vez en cuando dejarlo a temperatura ambiente durante 1 hora;
② Filtrar con papel de filtro, sellar el carbón activado con papel de filtro y desechar. 1. Principio El gel de poliacrilamida está compuesto de monómero de acrilamida, catalizador de polimerización en cadena N, N, N', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), persulfato de amonio y agente reticulante N, N'-metilenbisacrilamida que se forma mediante una reacción química. Los monómeros de acrilamida se polimerizan bajo la acción de catalizadores para formar cadenas largas, que se entrecruzan mediante agentes reticulantes para formar geles. El tamaño de los poros está determinado por la longitud de la cadena y el grado de reticulación. La longitud de la cadena depende de la concentración de acrilamida y el grado de reticulación del polímero se puede cambiar ajustando la relación de concentración de acrilamida y agente reticulante.
La electroforesis en gel de poliacrilamida puede lograr una separación basada en la carga, el tamaño molecular y la forma de la muestra de electroforesis. Tiene efectos electrostáticos y de tamiz molecular y tiene una resolución más alta que la electroforesis en gel de agarosa. Se pueden aislar fragmentos de ADN que difieren solo en 1 nucleótido.
La electroforesis en gel de poliacrilamida se utiliza para analizar y preparar fragmentos de ADN de menos de 1 kb de longitud. Dependiendo del tamaño de los fragmentos de ácido nucleico a separar, se pueden preparar geles de diferentes concentraciones.
2. Preparación del gel y electroforesis Dado que el oxígeno puede inhibir la polimerización de la acrilamida, el llenado del gel de poliacrilamida suele realizarse entre un sándwich formado por dos placas de vidrio cerradas. En este dispositivo, sólo la capa superior de gel está en contacto con el oxígeno del aire, lo que reduce en gran medida el efecto inhibidor del oxígeno sobre la polimerización. La electroforesis en gel de poliacrilamida generalmente utiliza un dispositivo vertical.
Las operaciones de preparación del gel y electroforesis son las siguientes:
(1) Reactivos de preparación
① 30% de acrilamida: 100 ml de agua bidestilada contienen 29 g de acrilamida y 1 g de acrilamida. N,N'-metilenbisacrilamida.
②Cada litro de solución 5× TBE contiene 54g de Tris. Ácido clorhídrico, 27,5 gramos de ácido bórico y 20 ml de EDTA 0,5 mol/L (pH 8,0).
③ Persulfato de amonio 10%: 10ml de agua bidestilada contienen 1g de persulfato de amonio.
(2) Frote previamente la placa de vidrio y la junta con detergente en el molde de goma del dispositivo, enjuáguelas con agua del grifo y agua desionizada y séquelas. Al instalar, coloque la placa de vidrio más grande sobre el banco de trabajo, coloque dos placas de respaldo a cada lado de la placa de vidrio, aplique una pequeña cantidad de vaselina, coloque la placa de vidrio superior en la placa de respaldo y use abrazaderas para sujetar la placa de vidrio. y Respalde la placa y selle el fondo con agarosa al 1%. Para evitar fugas de pegamento, a excepción de un lado del peine, los otros tres lados deben sellarse con cinta impermeable.
(3) Calcule la cantidad de solución de gel necesaria en función del tamaño de la placa de vidrio y el grosor de la capa intermedia, y prepare la solución (100 ml) según la siguiente tabla. La concentración de la solución de gel de poliacrilamida es 3,5 5,0 8,0 12,0 20,0 30% acrilamida (ml) 116.626.40.066 agua (ml). 67,7 62,7 52,7 39,3 12,7 5×tbe (ml) 20,0 20,0 Persulfato de amonio al 10 % (ml) 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 Añadir 35 μl de TEMED a 100 ml de solución mixta y mezclar.
(4) Inserte inmediatamente el peine de electroforesis para evitar que se formen burbujas debajo de los dientes del peine.
(5) Después de la polimerización a temperatura ambiente durante 65438 ± 0 horas, aparece una banda de refracción debajo de los dientes del peine, lo que indica que la reacción de polimerización se ha completado. Si el gel no se utiliza inmediatamente, se puede cubrir con una gasa o papel de filtro (empapado en 1×TBE) y almacenar a 4°C durante 1-2 días.
(6) Saque el peine y enjuague el orificio de muestreo con agua inmediatamente.
(7) Retire la cinta inferior y coloque el gel verticalmente en el tanque de electroforesis. Llene los tanques superior e inferior con solución 1×TBE para expulsar las burbujas de aire adheridas al fondo del gel.
Lave el pocillo de muestra con solución 1×TBE;
(8) Mezcle la muestra de ácido nucleico con una cantidad adecuada de tampón de carga de gel 6x (consulte la Tabla 2-28) y agréguelo al pocillo de carga de gel;
(9) Enciende la fuente de alimentación y conecta el ánodo al tanque inferior. El voltaje generalmente se controla a 1,8v/cm. Cuando el voltaje es demasiado alto, el calor generado por el gel puede hacer que las tiras de ADN se doblen o incluso que se derritan pequeños fragmentos de ADN.
(10) Después de la electroforesis, retire la placa de vidrio y el gel, colóquelo en el banco de trabajo, ábralo suavemente desde una esquina de la capa intermedia, retire con cuidado la placa de vidrio superior y retire con cuidado el gel. Tiñe la solución de tinción y observa los resultados.
3. Se utilizan comúnmente la tinción de gel y la observación de la tinción de bandas de ácido nucleico en geles de poliacrilamida. El método de tinción para el primero es el mismo que para el gel de agarosa.
El método de tinción con plata tiene alta sensibilidad y el funcionamiento es el siguiente:
(1) Fijar el gel en una solución estática (10% etanol, 0,5% ácido acético glacial) durante 10 minutos;
(2) Lavar con agua bidestilada 1-2 veces;
(3) Ponerlo en una solución de AgNO3 de 0,01 mol/L y reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5- 30 minutos;
(4) Lavar bien;
(5) Poner en una solución mixta de NaOH y formaldehído (200 ml de NaOH al 3%, que contiene 1 ml de formaldehído) para que reaccione hasta que el color de la banda desaparezca. claro y el fondo es adecuado;
p>(6) Terminar la reacción con ácido acético glacial al 5%.