Función de la hemocianina
La hemocianina es una proteína con iones de cobre monovalentes como grupo protésico. Existe en la sangre de moluscos (como pulpos, calamares, caracoles, etc.) y artrópodos (como cangrejos, camarones, arañas, etc.). La función fisiológica de la hemocianina es transportar oxígeno. El cobre de la oxihemocianina es Cu (II) y es azul. Tiene un pico de absorción cercano a 347 nm, que se genera por la transición dd en el campo tetraédrico retorcido. La desoxihemocianina es incolora. La tecnología de difracción de rayos X ha aumentado considerablemente la comprensión de la gente sobre la hemocianina. Aunque aún no se ha determinado la estructura cristalina de la hemocianina de cuerpo blando, proporciona información estructural de la parte activa de la molécula de hemocianina para el análisis de la estructura cristalina de la hemocianina de artrópodos. La subunidad de hemocianina de la langosta consta de tres regiones estructurales. La región I son los primeros 175 residuos de aminoácidos de la proteína y tiene una gran cantidad de estructuras secundarias de hélice α, la mayor parte de la región II también es una estructura secundaria de hélice α, que consta de 225 residuos de aminoácidos (176 a 400) y oxígeno; El sitio de enlace molecular está compuesto por iones de cobre dobles; los 258 residuos de aminoácidos restantes (401 a 658) constituyen la región III y son similares a la estructura secundaria de lámina β de otras proteínas como la superóxido dismutasa. En el doble centro activo de cobre en la región II, cada ion cobre está coordinado con el nitrógeno imidazol de tres residuos de histidina. Cuando no están oxigenados, la distancia entre los dos iones de cobre es de aproximadamente 46 pm y la interacción es muy débil. No se encuentra ningún puente proporcionado por la propia proteína entre los dos iones de cobre. En este momento, la coordinación entre cada ion cobre y el nitrógeno imidazol de los tres residuos de histidina es básicamente una configuración geométrica triangular. Después de la oxigenación, Cu (Ⅱ) tiene cuatro o cinco coordenadas, con dos iones de cobre y dos átomos de oxígeno (aniones peróxido) y los cuatro grupos de residuos de aminoácidos más cercanos a los iones de cobre entre los seis residuos de histidina. La base imidazol. El nitrógeno está fuertemente coordinado. En este momento, en un plano aproximado, cada ion cobre asume una configuración geométrica cuadrada plana, que es la situación de coordinación más favorable para el Cu (II). Las moléculas de oxígeno conectan dos Cu(Ⅱ) en forma de un puente de peroxígeno, y los dos Cu(Ⅱ) están separados por aproximadamente 36 pm.
Los químicos están interesados en compuestos modelo para sintetizar hemocianina. En 1978, Simmons M G y Wilson L J sintetizaron un complejo de Cu (Ⅰ) con imidazol como ligando, que puede transportar oxígeno de manera reversible a temperatura ambiente, ya sea una solución o un sólido. Utilice 2,6diacetilpiridina para condensar con histamina para obtener el ligando 2,6[1(2imidazol4etilenimino)etil]piridina y luego agregue [Cu(Ⅰ)(MeCN)4](ClO4). da un complejo rojo oscuro [Cu(Ⅰ)](ClO4).
Este complejo existe como monómero en solución. El número de coordinación del ion Cu (Ⅰ) es 5. Cuando se expone al aire a temperatura ambiente, la solución cambia rápidamente de rojo a verde. La reacción se completa después de aproximadamente 2 minutos y se absorbe 1 mol de O2 por cada 2 moles de Cu(Ⅰ). Si la solución transportadora de oxígeno se calienta a aproximadamente 40 °C y se utiliza nitrógeno para expulsar el gas, o la solución se agita a presión reducida, se producirá fácilmente una reacción inversa de desprendimiento de oxígeno y la solución volverá a su color rojo original. color. Experimentos repetidos confirmaron que puede transportar oxígeno de forma reversible. En base a esto, se especula que puede existir la siguiente reacción LCuⅠ + O2? LCuⅡO LCuⅡO + CuIL? LCuⅡO CuⅡL La hemocianina tiene un efecto antiviral no específico. Se usó cromatografía de afinidad para aislar dos polipéptidos del suero de Penaeus monodon que pueden unirse al virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) y al iridovirus (virus del irido del mero de Singapur, SGIV). Los pesos moleculares eran 73 ku y 75 ku respectivamente. identificado como hemocianina mediante análisis de espectrometría de masas. Se mezclaron hemocianina y virus y se agregaron al medio de cultivo celular. Después de 3 días de cultivo, se encontró que las células estaban sólo ligeramente dañadas. Las células del grupo de control sin hemocianina fueron completamente lisadas. Si se prolonga el tiempo de cultivo, las células del grupo de prueba también se lisarán una tras otra.
Luego se seleccionaron seis tipos de virus de ADN o ARN (SGIV, FV3, LDV, ThRV, ABV e IPNV) para el análisis y los resultados encontraron que sus concentraciones semiinhibitorias (CE) eran aproximadamente de 4,56 mg/L a 6,64 mg/L. . Estos resultados indican que la hemocianina es un inhibidor viral potencial en concentraciones bajas, pero la hemocianina no puede inhibir completamente la replicación viral.
La investigación ha encontrado que las dos subunidades de hemocianina tienen grandes diferencias en la función inmune. Lei K Y et al informaron que las dos subunidades de hemocianina con masas moleculares de 73 ku y 75 ku son solo 75 La subunidad PjHcL. de ku tiene función antiviral, pero la subunidad PjHcY no, lo que significa que las dos subunidades sanguíneas pueden desempeñar funciones diferentes. A partir de la comparación de secuencia y estructura, se encontró que aunque estas dos subunidades están altamente conservadas, muestran ciertas diferencias en el dominio N-terminal y el dominio C-terminal. Al comparar las estructuras de aminoácidos de las dos subunidades, se encontró que las estructuras de las dos subunidades eran idénticas en el sitio de unión del ion cobre y en la segunda región funcional, solo las configuraciones de aminoácidos α y β de la subunidad PjHcL y la subunidad PjHcY. la tercera región funcional eran diferentes. Lei et al. utilizaron tecnología RT-PCR para verificar con precisión este resultado y descubrieron las diferentes funciones inmunes de las dos subunidades, proporcionando una base más clara para futuras investigaciones sobre las funciones inmunológicas de la hemocianina.
En resumen, la función de defensa inmune de la hemocianina es el último descubrimiento en el campo de la inmunología de invertebrados en los últimos años, en la reacción inmune solo puede exhibir la función de fenol oxidasa y puede escindirse para producir. diferentes moléculas fragmentos antibacterianos de gran tamaño para resistir la invasión de patógenos. Aunque su mecanismo inmunológico aún no está claro, se cree que su situación exacta se aclarará con la evolución de los invertebrados. En los últimos años, estudios nacionales y extranjeros han demostrado que la hemocianina y sus fragmentos escindidos tienen múltiples funciones inmunes. Zhang Yueling utilizó P. vannamei recolectado de Shantou como objeto de investigación y utilizó métodos como cromatografía de afinidad, PAGE, SDSPAGE, Western blot, prueba de hemaglutinación y prueba de inhibición de azúcar para explorar la actividad de hemaglutinación de la hemocianina de P. vannamei. Los resultados mostraron que la hemocianina tiene una importante actividad de aglutinación de hemocitos en los cuatro tipos de glóbulos rojos seleccionados en la prueba: pescado, pollo, ratón y humano. La actividad de aglutinación oscila entre 5 mg/L y 10 mg/L, y su reacción de aglutinación. Puede ser inhibido significativamente por cuatro azúcares, incluidos la αgalactosa, la αD glucosa, el manitol y el ácido Nacetilneuramínico. Sin embargo, en comparación con las lectinas generales, la actividad de aglutinación de la hemocianina es aproximadamente de 1 a 2 órdenes de magnitud menor. Su abundancia en el suero de camarón puede compensar su falta de actividad de aglutinación. En estudios anteriores, se descubrió que el pico del espectro de masas de péptidos de las manchas de proteína de hemocianina podría coincidir con la hemaglutinina del virus de la influenza, con una cobertura de secuencia del 37%. Se especula que la hemocianina tiene actividad de hemaglutinación, lo cual es de gran importancia para futuras investigaciones sobre la función inmunológica de la hemocianina.
La investigación ha confirmado que la hemocianina puede haber evolucionado a partir de la fenol oxidasa, y que la activación del sistema de cascada de fenol oxidasa está estrechamente relacionada con el mecanismo de coagulación de las proteínas de coagulación en los crustáceos. Los estudios han encontrado que la hemocianina también tiene actividad aglutinante. Estos hallazgos sugieren que la hemocianina, la fenoloxidasa y la proteína de coagulación pueden haber evolucionado a partir de la misma proteína, mientras que la hemocianina, una molécula multifuncional, conserva todas sus funciones inmunológicas. Los péptidos antimicrobianos producidos por la escisión de hemocianina están asociados con respuestas inmunes en camarones. Recientemente, se aislaron tres péptidos activos antifúngicos cargados negativamente de la hemolinfa del camarón blanco del Atlántico y Penaeus vannamei, con una identidad del 95 % al 100 % con la secuencia C-terminal de la hemocianina. Cuando se infectaron camarones, la concentración del péptido activo de la secuencia C-terminal de la hemocianina aumentó en la hemolinfa, lo que indica que la escisión de la hemocianina fue causada por señales biológicas. Lee S Y et al. obtuvieron un péptido antimicrobiano compuesto de 16 aminoácidos del plasma de cangrejo de río de agua dulce, que puede inhibir el crecimiento de bacterias G+ y G-. Este péptido antimicrobiano se produce mediante la escisión de la hemocianina por proteasa en condiciones ácidas. Las inyecciones de lipopolisacárido y dextrano promueven la producción de hemocianina y la liberación de este péptido. Esto muestra que los péptidos antimicrobianos pueden inducirse, liberarse y activarse para que desempeñen un papel en la defensa inmune del cuerpo. Zhang Y L et al. también aislaron una proteína similar a IgG del suero de Penaeus vannamei que reaccionaba específicamente con IgG antihumana de cabra y se detectó como hemocianina.
El estudio encontró que, además del sitio de unión de cobre, también hay una región conservada similar a Ig que consta de 252 aminoácidos en el extremo C de la hemocianina. Además, se encontraron 4 y 1 regiones conservadas similares en la cadena pesada y la cadena k de hemocianina e Ig, respectivamente. Es muy probable que estas regiones conservadas similares a las Ig doten a los pigmentos respiratorios de los crustáceos de nuevas funciones, permitiéndoles ejercer mejor efectos antimicrobianos. Aunque el mecanismo de procesamiento de la hemocianina no está muy claro hasta el momento, no se puede ignorar su papel en el sistema inmunológico de los crustáceos. Por lo tanto, se llevan a cabo investigaciones profundas y detalladas para aclarar su mecanismo inmunológico para los crustáceos económicos, el control de enfermedades es crucial.
En los últimos años, con el descubrimiento continuo de diversas funciones de la hemocianina, especialmente el descubrimiento de la actividad inmune, la función, el mecanismo de acción y el estado evolutivo de la hemocianina han despertado un gran interés por parte de académicos de varios países. Es esencial realizar más investigaciones sobre la función de la hemocianina para enriquecer y desarrollar la fisiología, la bioquímica y el sistema inmunológico de los invertebrados, especialmente los crustáceos, y explorar la inmunidad. Estos resultados muestran que la hemocianina tiene funciones antibacterianas, fúngicas y virales de amplio espectro y un mecanismo único de acción. acción puede convertirse en una nueva fuente de fármacos antibacterianos, antivirales y antitumorales. China es un importante país marítimo. El desarrollo y utilización de recursos de hemocianina de animales marinos proporcionará un marco y una plantilla de diseño molecular ideal para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos, sentando una base importante para el desarrollo de nuevos fármacos antiinfecciosos. Además, la investigación sobre la hemocianina del camarón ha profundizado la comprensión de las personas sobre el mecanismo de defensa inmune de los vertebrados inferiores y ha abierto una nueva vía para la prevención y el tratamiento de enfermedades cada vez más graves del camarón. Al mismo tiempo, con el desarrollo de la tecnología transgénica de camarón, es posible obtener nuevas variedades resistentes a enfermedades mediante la conversión de genes de hemocianina. Se cree que con la continua profundización de la investigación, la hemocianina del camarón desempeñará un papel importante en el desarrollo sostenible de las pesquerías acuáticas del mundo.